吳安慶, 田欣,*

1. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院,蘇州 215123

2. 放射醫(yī)學(xué)與輻射防護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(蘇州大學(xué)),蘇州 215123

我國(guó)大氣顆粒物污染嚴(yán)重,其主要是由粒徑＜100 μm 的微米級(jí)顆粒和近年來才引起關(guān)注的粒徑＜100 nm 的納米級(jí)顆粒組成[1]。 在城市環(huán)境和部分工業(yè)場(chǎng)所的空氣中都含有大量納米顆粒物,可以通過形成氣溶膠,經(jīng)呼吸道進(jìn)入人體,嚴(yán)重影響人體健康[2]。 這些納米顆粒進(jìn)入人體后,首先損傷呼吸器官,甚至能夠進(jìn)入血液,穿過血腦屏障,在細(xì)胞和分子等水平上影響機(jī)體組織和器官的功能,甚至改變基因的表達(dá)[3]。 因此,納米顆粒對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響不容忽視。 氧化石墨烯(graphene oxide, GO)又稱功能化石墨烯,是一種由碳原子組成的單層蜂窩晶格材料,具有電學(xué)、光學(xué)、力學(xué)特性和良好的生物相容性,被廣泛應(yīng)用于材料學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和藥物傳遞等諸多領(lǐng)域[4]。 因GO日益增多的生產(chǎn)和使用,很有可能在生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用和廢物處理等過程中進(jìn)入環(huán)境,在空氣、水和土壤中大量積累[5-6]。 GO 對(duì)環(huán)境吸附物表現(xiàn)出不同的吸附性能,能夠吸附在其他空氣顆粒物表面被人體吸入,可能引起吸入性肺損傷、呼吸系統(tǒng)過敏性疾病等。 因此,GO 的生物安全性引發(fā)了研究者的高度關(guān)注,尤其是對(duì)呼吸系統(tǒng)的損傷作用及機(jī)制仍然需要深入研究[7]。 本文通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),研究GO 對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞增殖及凋亡的影響,初步闡明GO 納米顆粒對(duì)呼吸系統(tǒng)的損傷機(jī)制,為納米氧化石墨烯的安全性評(píng)價(jià)及其誘發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

人支氣管上皮細(xì)胞株BEAS-2B 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù);GO 納米片,含氧量35.29%,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司;胎牛血清、青霉素-鏈霉素、RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) GIBCO 公司;0.25%含EDTA 胰酶、RIPA 細(xì)胞裂解液、蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、MTT 試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司;鼠抗人 Caspase-3、Bcl-2、GAPDH 單克隆抗體、兔抗人Bax、PARP 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;PI 和Annexin-V 探針細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司;活性氧(ROS)熒光探針-DHE 購(gòu)自中國(guó)威格拉斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

流式細(xì)胞儀(Verse,BD 公司,美國(guó));原子力顯微鏡(Dimension Icon,BRUKER 公司,德國(guó));電泳儀(Mini Protean Tetra,Bio-Rad 公司,美國(guó));化學(xué)-熒光發(fā)光顯影儀(FluroChem M1,Alpha 公司,美國(guó));顯微鏡(IX70,Olympus 公司,日本);二氧化碳培養(yǎng)箱(3111,Thermo Fisher 公司,美國(guó));離心機(jī)(5804R,Eppendorf 公司,德國(guó))等。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

在96 孔板中每孔接種4×103個(gè) BEAS-2B 細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h;加入不同濃度的GO。 24 h 后,每孔加入 10 μL 5×103mg·L-1的噻唑藍(lán)(MTT)溶液處理4 h,輕輕吸去所有液體,加入100 μL 二甲基亞砜(DMSO)后振蕩溶解結(jié)晶;用酶標(biāo)儀在570 nm/630 nm 雙波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)

在6 孔板中每孔接種1×105個(gè)BEAS-2B 細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,除去舊的培養(yǎng)基加入相同體積的新培養(yǎng)基后,加入不同濃度的GO,孵育24 h;收集細(xì)胞加入100 μL 磷酸緩沖溶液(PBS),溶液中包含10 μmol·L-1ROS 熒光探針-DHE 染料,37 ℃下孵育 30 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè)

各組細(xì)胞經(jīng)GO 處理24 h 后,用0.25%的胰酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液;用75%的乙醇(-20 ℃預(yù)冷)固定細(xì)胞;加入 PI(終濃度5×104mg·L-1)和 RNA酶(終濃度 5×104mg·L-1)染色20 min;上機(jī)前用200~400 目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

各組細(xì)胞經(jīng)GO 處理24 h 和48 h 后,收集細(xì)胞上清于15 mL 離心管中,PBS 洗2 遍的廢液也收集到15 mL 離心管中;0.25%含EDTA 胰酶消化后,將細(xì)胞收集于上一步的15 mL 離心管中,離心收集細(xì)胞;將上一步中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中,并加入100 μL PBS 重懸,加入 7-AAD 和 Annexin-V探針各5 μL,混勻,室溫避光15 min;用PBS 補(bǔ)足體積至400 μL;用流式細(xì)胞儀分析。

1.7 Western-blot 實(shí)驗(yàn)

各組細(xì)胞經(jīng)GO 處理24 h、48 h 后,加入細(xì)胞裂解液(RIPA)裂解細(xì)胞,利用BCA 試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量;以10%的SDS-聚丙烯凝膠電泳分離各蛋白,切取所需片段,轉(zhuǎn)移到硝化纖維薄膜上;利用脫脂牛奶封閉1 h,加入一抗置于4 ℃孵育過夜,TBST 緩沖液洗滌3 次,再用二抗處理1 h,TBST 緩沖液洗滌3 次;應(yīng)用ECL 顯影劑在化學(xué)-熒光發(fā)光顯影儀上顯影并拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3 次及以上,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 mean±SD 表示。 采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 相同處理組與對(duì)照組之間比較采用Student’st檢驗(yàn),以*P＜0.05、**P＜0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 GO 納米片的形貌與尺寸

采用原子力顯微鏡(AFM)檢測(cè)了GO 納米片的形貌和厚度,如圖1 所示,GO 納米片是單層或多層的片狀結(jié)構(gòu),粒徑為1 ~5 μm,厚度為2 nm 左右。在AFM 下測(cè)量GO 納米片的尺寸,統(tǒng)計(jì)100個(gè)GO納米片的平均長(zhǎng)度是(392.7±61.3) nm。

圖1 原子力顯微鏡(AFM)觀察氧化石墨烯(GO)的形貌與尺寸Fig.1 Atomic force microscope (AFM) image of graphene oxide (GO) nanosheets

2.2 GO 對(duì)細(xì)胞活性的影響

各組細(xì)胞經(jīng)GO 處理24 h 后,檢測(cè)各組細(xì)胞的活性,發(fā)現(xiàn)隨著GO 的濃度遞增,細(xì)胞的活性逐漸減低,細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢,大量細(xì)胞形態(tài)不正常,如圖2 所示,其中 200 mg·L-1時(shí),細(xì)胞活力降到 30%,提示GO 對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性作用。 另外,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的側(cè)向角散射光信號(hào)(side scatter, SSC)信號(hào)可以反映細(xì)胞內(nèi)的顆粒度,顯示細(xì)胞內(nèi)吞GO 顆粒的多少,如圖3 所示,隨GO 的濃度遞增,細(xì)胞的SSC 信號(hào)也逐漸增強(qiáng)。

圖2 GO 對(duì)細(xì)胞活性的影響注:(a)~(d) 不同濃度 GO 處理對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響:(a)0 mg·L-1,(b)50 mg·L-1,(c)100 mg·L-1,(d)200 mg·L-1;*表示 P＜0.05,**表示 P＜0.01。Fig.2 The effect of GO on cell activityNote: (a)~(d) the effect of GO treatment at different concentrations on cell morphology, (a)0 mg·L-1, (b)50 mg·L-1,(c)100 mg·L-1, (d)200 mg·L-1; *represents P＜0.05, **represents P＜0.01.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)吞GO 顆粒的量注:(a) 不同濃度GO 處理后細(xì)胞的SSC 信號(hào),(b) SSC 信號(hào)強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析;*表示P＜0.05,**表示P＜0.01。Fig.3 The endocytosis amount of GO particles was detected by flow cytometryNote: (a) Side scatter (SSC) signal of the cells treated with different concentrations of GO, (b) Statistical analysis of relative SSC signal intensity;*represents P＜0.05, **represents P＜0.01.

2.3 GO 促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生

ROS 是體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物,廣泛存在于生物體內(nèi)[5]。 正常情況下,細(xì)胞內(nèi)的ROS 主要由線粒體呼吸作用產(chǎn)生,ROS 濃度可以在胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)下保持在正常的生理水平。 研究報(bào)道GO 對(duì)生物體的主要毒性機(jī)制之一是通過誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生ROS,導(dǎo)致生物體遭受氧化損傷。 本研究使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了不同濃度GO 處理24 h 后,細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平,如圖4 所示,隨著GO 的濃度遞增細(xì)胞內(nèi)ROS 逐漸增多。

圖4 不同濃度的GO 處理細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生量注:(a) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度GO 處理后細(xì)胞內(nèi)的ROS-DHE 熒光強(qiáng)度,(b) ROS-DHE 熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析;*表示P＜0.05,**表示P＜0.01。Fig.4 The production of intracellular reactive oxygen species (ROS) in the cells treated with different concentrations of GONote: (a) ROS-DHE fluorescent intensity of the cells treated with different concentrations of GO, (b) Statistical analysis of ROS-DHE fluorescent intensity; *represents P＜0.05, **represents P＜0.01.

2.4 GO 引起細(xì)胞周期阻滯

GO 能夠引起胞內(nèi) ROS 水平上升,而過多的ROS 會(huì)氧化細(xì)胞內(nèi)生物大分子,破壞其正常分子結(jié)構(gòu),其中DNA 分子比較容易受到ROS 破壞,導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到影響。 利用PI 染色技術(shù)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)GO 對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞周期的影響,如圖5 所示,在GO 處理24 h 后,對(duì)照組的 G2/M 期比例為(16.09±1.34)%,而各GO 處理組都在對(duì)照組的2 倍以上,且隨著GO 濃度遞增,阻滯在G2/M 期的細(xì)胞越多,提示GO 能夠引起DNA 分子損傷,導(dǎo)致DNA不能正常復(fù)制,細(xì)胞不能正常分裂成2個(gè)細(xì)胞,引起有絲分裂異常。

圖5 不同濃度GO 對(duì)細(xì)胞周期的影響注:(a)0 mg·L-1;(b)50 mg·L-1;(c)100 mg·L-1;(d)200 mg·L-1 。Fig.5 Effects of different concentrations of GO on cell cycleNote: (a)0 mg·L-1; (b)50 mg·L-1; (c)100 mg·L-1; (d)200 mg·L-1.

2.5 GO 引起細(xì)胞凋亡

當(dāng)細(xì)胞周期不能正常進(jìn)行時(shí),細(xì)胞通常會(huì)啟動(dòng)程序性死亡。 因此,本研究檢測(cè)了GO(100 mg·L-1)處理的 BEAS-2B 細(xì)胞凋亡情況,如圖6 所示,取GO 處理后24 h 和48 h 這2個(gè)時(shí)間點(diǎn),進(jìn)行凋亡染色檢測(cè)。 GO 加入24 h 后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡,其中早期凋亡細(xì)胞占14.07%,晚期凋亡細(xì)胞占15.07%,而到48 h,晚期凋亡占23.95%,說明細(xì)胞凋亡情況加重,凋亡率上升。 另外,細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax、DNA 修復(fù)酶 PARP(poly ADP-ribose polymerase, PARP)的表達(dá)也受到GO 的影響。 如圖7 所示,在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入GO,培養(yǎng)24 h 和48 h后Caspase-3 明顯被活化,48 h 的cleaved Caspase-3和cleaved PARP 急劇增多,表達(dá)量明顯多于對(duì)照組。 另外,促凋亡蛋白 Bax 表達(dá)增多,而抑凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)逐漸減少。 說明GO 進(jìn)入細(xì)胞后,破壞了細(xì)胞生物大分子的結(jié)構(gòu),嚴(yán)重影響細(xì)胞的生理活動(dòng),從而激活細(xì)胞凋亡相關(guān)通路,上調(diào)了促凋亡蛋白,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖6 GO(100 mg·L-1)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響注:(a) 未加GO 處理,(b) GO 處理24 h,(c) GO 處理48 h,(d) 細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)分析;**表示P＜0.01。Fig.6 The effect of GO (100 mg·L-1) on apoptosisNote: (a) Without GO treatment, (b) GO treatment for 24 h, (c) GO treatment for 48 h, (d) Statistical analysis of apoptosis rate; **represents P＜0.01.

圖7 GO(100 mg·L-1)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of GO (100 mg·L-1) on apoptosis proteins

3 討論(Discussion)

氧化石墨烯作為石墨烯的氧化產(chǎn)物,由于其獨(dú)特的物化性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于眾多行業(yè),進(jìn)入人們的日常生活環(huán)境中,對(duì)人類健康不可避免地產(chǎn)生一定的影響。 當(dāng)GO 納米顆粒以氣溶膠的形式通過呼吸道進(jìn)入人體后,破壞肺部正常結(jié)構(gòu),甚至進(jìn)入血液循環(huán)對(duì)人體的免疫功能、心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等產(chǎn)生危害,引起各種各樣的疾病,還可能存在其他潛在和不可預(yù)測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)。 目前,大量毒理研究發(fā)現(xiàn)GO可以進(jìn)入生物體并引起一定的氧化損傷、細(xì)胞毒性、遺傳毒性和發(fā)育毒性[6-10]。 但是,GO 引起細(xì)胞損傷的分子生物學(xué)機(jī)制還尚未完全闡明,有待進(jìn)一步深入研究。 已有文獻(xiàn)報(bào)道GO 的細(xì)胞毒性和胞內(nèi)ROS水平升高有關(guān)[11-13]。 ROS 是細(xì)胞內(nèi)正常代謝的產(chǎn)物,低濃度的ROS 具有有益的生理功能,其通過激活胞漿內(nèi)的第二信使,參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞死亡等過程。 但是,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS 濃度過高時(shí),可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激,直接作用于蛋白質(zhì)、脂類和核酸,造成氧化損傷,引起癌癥、糖尿病、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和衰老等[14]。 本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),GO 處理BEAS-2B 細(xì)胞后,能夠引起胞內(nèi)ROS 顯著增多,進(jìn)而引起細(xì)胞周期阻滯,誘發(fā)細(xì)胞凋亡。 眾所周知,ROS 可以氧化細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 分子,從而影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和代謝。 另外,ROS 增加還可以引起線粒體膜去極化,促進(jìn)Caspase 激活。 對(duì)凋亡通路中的相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)吞GO 后激活了Caspase-3 介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路。 Caspase-3 可通過Fas 介導(dǎo)的死亡信號(hào)途徑,降解凋亡抑制蛋白Bcl-2,促進(jìn)促凋亡蛋白Bax 的表達(dá),同時(shí)催化DNA修復(fù)酶PARP 的裂解,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15-16],說明細(xì)胞凋亡是GO 的主要毒理效應(yīng)。 因此,當(dāng)GO 被人體吸入后,很可能對(duì)鼻黏膜、支氣管上皮造成嚴(yán)重?fù)p傷,誘發(fā)呼吸道感染,導(dǎo)致不同程度的肺部疾病。隨著石墨烯及其衍生物納米材料的廣泛引用,越來越多的含有GO 的固體廢物被排放到環(huán)境中,其對(duì)人體的危害不容忽視,不僅要有嚴(yán)格的工業(yè)排放標(biāo)準(zhǔn)和有效的廢物處理方法。 同時(shí),要分析其對(duì)人和動(dòng)物細(xì)胞毒理作用機(jī)制,在分子生物學(xué)水平上為疾病的治療提供更直接、更有價(jià)值的理論依據(jù)。