張平安，高娜，陳明哲，李瀟寧，紀國超，吳建軍*

（1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo‐nary disease,COPD）簡稱慢阻肺，是以持續(xù)呼吸道癥狀和氣流受限為特征的慢性氣道炎癥疾病，發(fā)病過程中外周氣道、肺實質(zhì)和肺血管中巨噬細胞、中性粒細胞以及包括Tc1、Th1、Th17和ILC3淋巴細胞等炎性細胞明顯增加，并釋放多種炎癥介質(zhì)[1]。COPD 因其逐年升高的發(fā)病率，正逐漸成為影響人們健康的慢性疾病。2017 年全球疾病負擔研究指出，全球慢阻肺患者數(shù)約3 億人，從2007 年到2017年增長了24.9%[2]。研究證明COPD 存在持續(xù)的氣道與全身炎癥反應，炎性介質(zhì)、免疫細胞以及趨化因子的水平可以預測COPD 的急性加重及預后[3]。而白介素8（IL-8）和腫瘤壞死因子受體（TNF-α），在AECOPD（acute exacerbation of COPD）和COPD 患者血清中的表達升高并且與COPD的嚴重程度呈正相關(guān)[4]。通過分析COPD 患者連續(xù)3 年每年發(fā)生≥1次AECOPD 的個體相關(guān)因素發(fā)現(xiàn)，COPD 頻繁急性加重表型與CT 表現(xiàn)的小氣道異常和白細胞介素8（IL-8）有關(guān)[5]。由此可知，IL-8可能通過參與炎癥反應而誘導慢阻肺的急性加重，而調(diào)控IL-8 則可能成為治療COPD的潛在或有效途徑之一。

2011年，有研究提出競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）可以通過其miRNA反應元件作為miRNA海綿以調(diào)節(jié)其表達的假設[6]。近年有研究證明lncRNAs 具有ceRNAs 作用，并且在惡性和慢性疾病中發(fā)揮重要作用[7]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)miR-122-5p-A2M-LINC00987相互作用可能在COPD 中發(fā)揮重要作用[8]，而miR-122-5p 又可能通過調(diào)節(jié)人血漿蛋白酶抑制劑（A2Mα2-巨球蛋白）以調(diào)節(jié)肺蛋白酶活性[9]。研究發(fā)現(xiàn)作為miRNA 調(diào)控的下游基因，白細胞介素（IL-8）可以通過調(diào)控ROCH 炎癥通路誘導氣道高反應性和促進氣道平滑肌痙攣，加重肺功能損害[10]。

但是目前IL-8在COPD的發(fā)病中其調(diào)控機制仍舊不明，因此本文擬通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選與IL-8表達相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探究IL-8表達調(diào)控相關(guān)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與預處理

本研究所采用的基因表達數(shù)據(jù)來源于GEO 基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。慢阻肺患者和正常對照組mRNA 數(shù)據(jù)來源于GSE5058、GSE38974，miRNA 數(shù) 據(jù) 來 源 于GSE24709，lncRNA數(shù)據(jù)來源于GSE107426。

1.2 獨立秩和檢驗比較IL-8的表達差異

利 用R3.5.2 軟 件 的limma 包 對GSE5058、GSE38974 數(shù)據(jù)的IL-8 表達量進行獨立樣本秩和檢驗，而Wilcoxon 秩和檢驗是一種流行的非參數(shù)檢驗，用于比較2 個獨立的總體的差異以篩選差異基因，數(shù)據(jù)格式為慢阻肺患者和正常對照組模式[11-12]。

1.3 基因富集分析

將GSE5058、GSE38974 數(shù)據(jù)中的慢阻肺患者按照IL-8 的表達量進行從高到低排序。按照IL-8表達量的中位數(shù)將患者分IL-8 高表達組和低表達組。本研究用GSEA（version 3.0）軟件對表達矩陣進行分析，采用c5.all.v7.2.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集，按照缺省參數(shù)設置進行GSEA，設定隨機組合次數(shù)為1000，|NES|>1，P<0.05 的基因集被認為是顯著富集的。

1.4 篩選IL-8 高表達的正負相關(guān)的差異基因，篩選差異miRNA、lncRNA，繪制IL-8環(huán)狀網(wǎng)絡圖

利用微生信在線數(shù)據(jù)平臺（http：//www.bioin‐formatics.com.cn）繪制upset 圖，對GSEA 基因富集分析的GSE5058、GSE38974 數(shù)據(jù)中與IL-8 高表達呈正、負相關(guān)的基因取交集；利用R3.5.2軟件的相關(guān)limma 包對miRNA 數(shù)據(jù)集GSE24709 數(shù)據(jù)進行差異miRNA 的分析，利用lncRNA 數(shù)據(jù)集GSE107426 篩選差異lncRNA，篩選條件為log2foldchange<-1，P<0.05 的miRNA 被認為是顯著低表達；并利用miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni?heidelberg.de/）篩選與IL-8 相互作用的miRNA；利用StarBase3 平臺（http：//starbase.sysu.edu.cn/）篩選與miRNA 互相作用的lncRNA，然后利用Cytoscape3.7.1 軟件繪制IL-8-miRNA-lncRNA網(wǎng)絡圖。

1.5 利用String 平臺篩選IL-8 高表達呈正負相關(guān)的關(guān)鍵基因

將IL-8 高表達呈正、負相關(guān)的基因輸入String平臺（https：//string-db.org/）構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡（pro‐tein-protein interaction,PPI），選取“Homo sapiens”為蛋白屬種，最低相互作用閾值“medium confidence”（>0.15），其他參數(shù)設置為默認參數(shù)，獲取PPI蛋白互作網(wǎng)絡，利用Cytoscape3.7.1 軟件中MOCDE 插件進行關(guān)鍵基因的篩選，篩選條件為Node Score Cutff：0.2，K-Core：2，Max Depth：100。

1.6 關(guān)鍵基因進行GO和KEGG富集分析

利用R3.5.2軟件中的clusterProfiler包對篩選出的IL-8 高表達呈正、負相關(guān)的關(guān)鍵基因進行GO 和KEGG富集分析，篩選條件為矯正后的P值<0.05。

2 結(jié)果

2.1 GEO樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計

通過GEO 數(shù)據(jù)庫篩選出符合慢阻肺患者和正常對照組對比的mRNA 數(shù)據(jù)GSE5058 數(shù)據(jù)包含慢阻肺患者15 例，正常對照組患者24 例，GSE38974數(shù)據(jù)包含慢阻肺患者23 例，正常對照組患者9 例；miRNA 數(shù)據(jù)集GSE49881 數(shù)據(jù)包含慢阻肺患者41 例，正 常 對 照 組 患 者16 例；lncRNA 數(shù) 據(jù) 集GSE107426 包含慢阻肺患者1 例，正常對照組患者1例。如表1所示。

表1 數(shù)據(jù)集及分布情況Table 1 Data set and distribution

2.2 慢阻肺患者和正常對照組IL-8表達差異

通過對慢阻肺患者和正常對照組IL-8 表達的水平發(fā)現(xiàn)，IL-8 在慢阻肺患者中顯著高表達。其中GSE5058 數(shù)據(jù)中IL-8 的P值為0.000331，log2fold‐change=1.3084674，如圖1A 所示；GSE38974 數(shù)據(jù) 中IL-8 的P值 為0.000418，log2foldchange=2.2547985，如圖1B所示。

圖1 IL-8在GEO數(shù)據(jù)集中的表達Figure 1 Expression of IL-8 in GEO dataset

2.3 GSEA基因富集分析結(jié)果

利用GSE5058 和GSE38974 這2 個數(shù)據(jù)集中的慢阻肺患者基因表達矩陣，分別計算IL-8 與其他基因表達的相關(guān)性。GSEA 分析發(fā)現(xiàn)有47 條通路顯著富集在IL-8 高表達患者中。如表2 所示，高IL-8患者富集的通路主要涉及細胞轉(zhuǎn)化和一些受體信號通路。對排名為前2 的通路進行了展示（圖2 A、B）。其中GSE5058 數(shù)據(jù)集 篩選到314 個顯著與IL-8 表達相關(guān)的基因（147 個正相關(guān)，167 個負相關(guān)）。GSE38974 數(shù)據(jù)集篩選到2239 個顯著與IL-8 表達相關(guān)的基因（692個正相關(guān)，1547個負相關(guān)）。

圖2 GSEA基因富集分析IL-8高表達顯著相關(guān)通路top2展示Figure 2 Top 2 pathways related to high expression of IL-8 by GSEA gene enrichment analysis

表2 IL-8高表達相關(guān)的前20條通路Table 2 Top 20 pathways related to high expression of IL-8

2.4 篩選IL-8 高表達呈正、負相關(guān)的基因，篩選差異miRNA,繪制相關(guān)網(wǎng)絡圖

通過微生信在線數(shù)據(jù)平臺（http：//www.bioin‐formatics.com.cn）繪制upset 圖，對GSEA 基因富集分析的GSE5058、GSE38974 數(shù)據(jù)集中IL-8 高表達呈正、負相關(guān)的基因取交集，一共得到111 個相關(guān)基因（36 個正相關(guān)，75 個負相關(guān)，如圖3 A、B 所示）；利用篩選得到的與IL-8相關(guān)的miRNA和miRNA相關(guān)的lncRNA 在Cytoscape3.7.1 軟件中繪制網(wǎng)狀圖，如圖3 C、表3所示，其中miRNA與mRNA呈負調(diào)控的關(guān)系；mRNA與lncRNA可競爭性作用于miRNA。

表3 差異miRNA和差異lncRNA表達結(jié)果Table 3 Differential miRNA and lncRNA expression results

2.5 利用String 平臺篩選差異基因蛋白互作網(wǎng)絡中的關(guān)鍵基因

通過String 平臺將IL-8 高表達呈正、負相關(guān)的基因的PPI 蛋白互作網(wǎng)絡并根據(jù)篩選條件得到IL-8表達相關(guān)的正相關(guān)基因有PTGS2、STAT3、IL1B、TNF、VEGFA等20 個；與IL-8 表達相關(guān)的負相關(guān)基因有PRKCZ、JUN、TGFB1、TP53、MAPK1等17 個，如圖3D、E所示

圖3 IL-8正負相關(guān)基因、IL-8-miRNA-lncRNA環(huán)狀網(wǎng)絡、IL-8正負相關(guān)基因PPI網(wǎng)絡關(guān)鍵基因篩選Figure 3 IL-8 positive and negative related genes，IL-8-miRNA-lncRNA ring network，and screening of key genes in PPI network of IL-8 positive and negative related genes

2.6 差異基因進行GO和KEGG富集分析

選取IL-8 表達正相關(guān)的基因進行GO 和KEGG富集分析，以分析IL-8 表達促進的功能（如圖4 C 所示）或通路（如圖4 D所示）。在GO功能方面上主要涉及細胞因子活性（cytokine activity）、G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合（G protein-coupled receptor binding）、激素活性（hormone activity）、激素受體結(jié)合（hormone receptor binding）、趨化因子受體結(jié)合（chemokine receptor binding）等通路的調(diào)控；KEGG 富集分析集中在IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、NF-κB信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、細胞因子-細胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine recep‐tor interaction）等通路上。選取IL-8 表達負相關(guān)的基因進行GO 和Kegg 富集分析，以分析IL-8 表達抑制的功能（如圖4 A所示）或通路（如圖4B所示）。在GO功能方面上主要涉及細胞因子受體結(jié)合（cyto‐kine receptor binding）、轉(zhuǎn)化生長因子β受體結(jié)合（transforming growth factor beta receptor binding）、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合（histone acetyltransferase binding）、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合（histone deacetylase binding）、磷脂酰肌醇3-激酶活性（phosphatidylinosi‐tol 3-kinase activity）等功能；KEGG 富集分析集中在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等通路中。

圖4 IL-8正負相關(guān)基因GO富集和Kegg通路富集結(jié)果Figure 4 GO enrichment and KEGG pathway enrichment of IL-8 positive and negative related genes

3 討論

IL-8 是一種有效的中性粒細胞募集和激活因子，與許多炎性肺?。毙院粑狡染C合征、慢性阻塞性肺疾病、哮喘）的發(fā)病機制有關(guān)，其機制通過釋放彈性蛋白酶而損傷肺功能[13]，且有研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗發(fā)現(xiàn)COPD 患者獲得的痰液標本中IL-8 水平升高[14]。而通過對比COPD 和正常人之間的轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，IL-8 在COPD 患者中顯著高表達，說明IL-8的高表達與COPD發(fā)病相關(guān)。

目前許多研究已經(jīng)證明lncRNA 可以與mRNA競爭性結(jié)合miRNA，以調(diào)控mRNA 的表達[15]。本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀通路中hsa-miR-106a-5p、hsa-miR429、hsa-miR-32-5p 等可以調(diào)控IL-8 的表達，而這一過程可 以 被USPS-AS1、CELF2-AS1、CELF2-AS2、SN‐HG5、DAPK1-1T1、MALAT1等lncRNA 競爭性抑制。研究表明miR-32-5p 可能通過上調(diào)NFIL3 及抑制炎性因子TNF-α、IL-6 的表達以抑制脂多糖誘導的肺上皮細胞凋亡和炎性反應[16]。在MicroRNAs 作為COPD 分級標志物的篩選、驗證及功能分析中通過實時熒光PCR 方法檢測COPD 患者和正常人外周血中miR-106a-5p 的表達，發(fā)現(xiàn)miR-106a-5p 在COPD 患者中顯著高表達，在COPD 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，與COPD 的嚴重程度相關(guān)[17]。有研究證明lncRNA SNHG5 可以通過SNHG5-miR-132-PTFN 軸調(diào)控miR-132 下游靶標PTEN 蛋白的表達，以減輕香煙煙霧刺激對COPD人支氣管上皮細胞的增殖、凋亡和炎癥（IL-1β、IL-6 和TNFα）反應[18]。還有研究表明lncRNA-MALAT1 可以通過調(diào)節(jié)MALAT1/miR-146a/COX2 軸，延緩COPD 肺功能的減低，并且可以減輕COPD 的慢性炎癥，有望成為預測COPD 嚴重程度的新型生物標志物[19]。結(jié)合IL-8-miRNA-lncRNA 環(huán)狀網(wǎng)絡可以得知，lncRNA中SNHG5、MALAT1可以通過競爭性結(jié)合miR-32-5p，發(fā)揮內(nèi)源性競爭IL-8 以調(diào)節(jié)IL-8 在COPD 中的作用，因此推測lncRNA 中SNHG5、MALAT1 可以通過SNHG5/MALAT1-miR-32-5p-IL-8 軸調(diào)控IL-8在COPD中的炎癥過程。

通過PPI蛋白互作網(wǎng)絡分析得知，與IL-8高表達呈正相關(guān)的基因為TNF、VEGFA、PTGS2、STAT3、IL1B等蛋白，與IL-8高表達呈負相關(guān)的基因為PRK‐CZ、JUN、TGFB1、TP53、MAPK1等蛋白；其中腫瘤壞死因子（TNF-α）作為COPD中的促黏附細胞因子，在COPD患者的血漿和痰液中明顯升高[20]，并且經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)TNF-α多態(tài)性基因表型可以影響慢性阻塞性肺疾病的臨床表型（增加發(fā)病率，使EV1下降增快、體重指數(shù)降低），此過程與肺分泌過表達TNF-α有關(guān)，并伴有IL-8等炎癥因子的過表達和增加的中性粒細胞遷移[21]。研究表明血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）在COPD 中顯著高表達并參與人肺微血管細胞的凋亡過程，miRNA-206可以誘導VEGFA的過表達，這一過程被miRNA-206 敲低顯著逆轉(zhuǎn)[22]。TP53 是一種應激反應基因，通過激活下游基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮基因毒性應激、致癌信號、細胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)TP53 持續(xù)下調(diào)及其下游CDKNIA通路可能是通過COPD向鱗狀細胞癌（SQCC）發(fā)展，與抑制細胞周期停滯和細胞凋亡有關(guān)[23]，因此推測高表達的IL-8 可能通過調(diào)節(jié)與其正負相關(guān)基因的表達來調(diào)控COPD 疾病的發(fā)生。

通過IL-8 表達正相關(guān)的基因進行GO 和Kegg富集分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)控正相關(guān)基因表達的通路也有如下功能：如GC 發(fā)揮作用需要與GC 受體結(jié)合，形成GC-GR 復合物，而炎性通路的激活則會降低受體的表達，減輕受體的活性，導致糖皮質(zhì)激素的不敏感[24]，而通過對慢阻肺疾病激素不敏感與糖皮質(zhì)激素受體核內(nèi)移的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，COPD 患者外周血中GRα的核內(nèi)轉(zhuǎn)移與GC 的敏感性呈正相關(guān)，而糖皮質(zhì)激素的減弱可能與GRα的核內(nèi)轉(zhuǎn)移受抑制/核內(nèi)GRα的降解有關(guān)[25]。還有研究表明，TNF-α/IL-17 信號通路可以靶向調(diào)控IL1B的表達，進而促進CSE 刺激引起的慢阻肺支氣管上皮細胞的增殖，并抑制其凋亡以干預COPD 的發(fā)展[26]。此外通過研究發(fā)現(xiàn)核因子（NF）κB 可以調(diào)節(jié)細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞黏附因子等多種靶基因的表達，進而調(diào)控各種組織細胞的炎癥與免疫反應、細胞凋亡及增殖分化等生理過程[27]，而NF-κB 信號通路的異常激活可以誘導TNF-α、IL-1β、IL-6 以及黏附分子等炎癥介質(zhì)的釋放，從而加重COPD的發(fā)生，通過抑制其通路可以阻斷COPD的進展[28]。

通過IL-8 表達負相關(guān)的基因進行GO 和Kegg富集分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)控負相關(guān)基因表達的通路有如下功能：慢性阻塞性肺疾病中持續(xù)存在的氧化應激反應可以降低肺組蛋白乙酰酶活性，打破組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶/組蛋白脫乙酰酶的平衡，進而導致組蛋白分子過乙?；⒃鰪娧装Y蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和炎癥蛋白的合成，最終能夠阻斷糖皮質(zhì)激素的抗感染效應[29]。另有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt 通路可干預HDAC2 的表達或活性，其機制為氧化應激反應激活PI3K/Akt 通路，使得該通路下游的信號蛋白Akt發(fā)生磷酸化，進一步影響其下游的HDAC2，引起HDAC2 活性下降或失活，導致炎癥基因的轉(zhuǎn)錄和炎癥因子的合成加強[30-32]。還有研究發(fā)現(xiàn)小青龍湯中槲皮素等成分可以通過HIF-1 信號通路調(diào)控IL-6 等炎癥因子的釋放以干預COPD 發(fā)生發(fā)展中的氧化應激、炎癥反應過程[33]。結(jié)合IL-8 表達正負相關(guān)基因的GO 和KEGG的研究發(fā)現(xiàn)，與IL-8 表達正負相關(guān)的基因可能通過調(diào)控組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合、激素活性和激素受體等生物過程，以及PI3KAkt 通路、HIF-1 信號通路、TNF-α/IL-17 信號通路、NF-kB 信號通路等信號通路在COPD 的發(fā)生過程中抑制糖皮質(zhì)激素敏感性、參與炎癥反應。

本研究利用生物信息學的研究方法，發(fā)現(xiàn)IL-8在COPD 疾病中顯著高表達，并且通過篩選miRNA和lncRNA 得到了IL-8-miRNA-lncRNA 環(huán)狀網(wǎng)絡，采用GSEA 軟件篩選出與高表達相關(guān)的正負相關(guān)mRNA，采用R 軟件發(fā)現(xiàn)部分GO 生物學過程和KEGG 通路涉及糖皮質(zhì)激素抵抗和炎癥反應的機制。本研究顯示，IL-8 有望成為治療COPD 的新靶點。