周建松 簡(jiǎn)潔 蔣家俊 劉小華 李婉宜

（1.貴陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，貴州 貴陽(yáng) 550000；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，四川 成都 610000）

沙門氏菌是一種常見的革蘭陰性桿菌致病菌，截止至2007 年，全球已發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)超過(guò)2579 種沙門氏菌血清型[1]。根據(jù)致病沙門氏菌種類的不同，可引起傷寒、敗血癥和腸胃炎的不同癥狀[2]。據(jù)報(bào)道，全球每年由沙門氏菌引起的感染人數(shù)約9380 萬(wàn)，感染者死亡的數(shù)量更是達(dá)到了15.5 萬(wàn)，美國(guó)CDC2013 年的調(diào)查顯示，在引起食物中毒的致病菌中，沙門氏菌的數(shù)量占據(jù)首位[2-3]。在中國(guó)，食品安全的問(wèn)題也很嚴(yán)峻，據(jù)資料顯示，細(xì)菌性食物中毒中約有70%～80%由沙門氏菌引起[4]。廣州、浙江、貴州多地均報(bào)道過(guò)由沙門氏菌引起的食物中毒事件[5-7]。

病原菌分型是疾病監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)研究的基礎(chǔ)，也是食物中毒事件污染源溯源的重要手段，目前對(duì)于沙門氏菌的分型主要分為血清分型和分子分型[8]。傳統(tǒng)血清分型具有操作難度低，高效快速等優(yōu)點(diǎn)，但目前已知沙門氏菌血清型種類多達(dá)2500種以上，且存在不典型沙門氏菌與較多干擾菌，因此，單純的血清分型已不能滿足食源性疾病的診斷及對(duì)致病菌溯源。脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）技術(shù)是利用DNA 分子處于電場(chǎng)作用下，在凝膠中遷移率不同而達(dá)到分離DNA分子的目的，進(jìn)而通過(guò)比較條帶相似性確定其親緣關(guān)系，其具有可重復(fù)性好，分辨力高的特點(diǎn)，是目前分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，現(xiàn)已被廣泛用于多種病原體爆發(fā)流行的溯源分析中[9]。

發(fā)生食源性事故時(shí)，應(yīng)盡快結(jié)合血清與PFGE分型技術(shù)對(duì)沙門菌進(jìn)行型別鑒定，確定并追蹤其來(lái)源，避免事件進(jìn)一步惡化[10]。本研究擬通過(guò)對(duì)貴陽(yáng)市2015 年至2020 年33 株食源性沙門氏菌進(jìn)行血清分型和PFGE 分子分型，評(píng)價(jià)不同血清型別的沙門氏菌親緣性，并為貴陽(yáng)市沙門氏菌感染的防控提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

33 株沙門菌分離自貴陽(yáng)市2015 年至2020 年的病例監(jiān)測(cè)、食物中毒和食品監(jiān)測(cè)。PFGE 標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812 來(lái)自貴州省疾病預(yù)防控制中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材

緩沖蛋白胨水、營(yíng)養(yǎng)瓊脂等（北京路橋），沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（法國(guó)科瑪嘉），SKG 瓊脂糖精（美國(guó)LONZA），1M Tris-HCL 緩沖液、0.5M EDTA、5×TBE（北京Solarbio），限制性內(nèi)切酶Xba1、10×Buff 緩沖液（美國(guó)BioLabs），蛋白酶K（德國(guó)Merck），PFGE 用梳子、模具（美國(guó)Bio-Rad），Gelred染液（美國(guó)Biotium），恒溫恒濕培養(yǎng)箱、水浴恒溫振蕩器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），脈沖凝膠電泳儀、成像儀（美國(guó)Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)核鑒定

參照《GB 4789.4-2016 沙門氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行。將貴陽(yáng)市疾控中心保存的目標(biāo)菌株的磁珠接種于緩沖蛋白胨水（Buffered peptone water，BPW），36℃培養(yǎng)16 h 后接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基中，繼續(xù)36℃培養(yǎng)18 h，通過(guò)其產(chǎn)生的顏色進(jìn)行初步篩選，挑取紫紅色可疑單獨(dú)菌落接種于三糖鐵瓊脂進(jìn)行二次判斷。

若生長(zhǎng)結(jié)果有異，可接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂（Nutrient agar，NA）36℃培養(yǎng)18 h 后，挑取單個(gè)菌落配置菌懸液進(jìn)行Vitek-2 生化鑒定。

1.2.2 血清型分型

將目標(biāo)菌株接種于NA，36℃培養(yǎng)19 h，取一個(gè)干凈無(wú)劃痕的培養(yǎng)皿，將診斷血清滴一滴于其上并挑取單個(gè)菌落與之混勻，在燈光下觀察其是否凝集。

凝集順序?yàn)椋合饶齇 血清，根據(jù)其凝集的O 血清的不同，參照對(duì)比表選擇H 血清，進(jìn)而確定其血清型。

1.2.3 PFGE 分子分型

該實(shí)驗(yàn)步驟以標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812 為對(duì)照。挑取目標(biāo)菌株單個(gè)菌落接種于NA 36℃培養(yǎng)18 h。稱取適量Seakem Glod（SKG）瓊脂糖，配置適量1% SKG瓊脂糖，熔化后放入55℃的恒溫箱備用。使用細(xì)胞懸浮液（Cell Suspension Buffer，CSB）制備麥?zhǔn)媳葷釢舛葹? 的菌懸液，取400 μL 菌懸液加入無(wú)菌1.5 mL 離心管中，加入25 μL 蛋白酶K，使用制膠模具制成膠塊。在50 mL 離心管中加入5 mL 細(xì)胞裂解液（Cell lysis buffer，CLB）與25 μL 蛋白酶K，放入膠塊后置于55℃轉(zhuǎn)速150 rpm 的震蕩水浴鍋裂解2 h。裂解結(jié)束后倒出液體，

使用超純水及TE 緩沖液（Tris :EDTA buffer，TE）進(jìn)行清洗。清洗完成后，加入常溫10 mLTE 放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用XbaⅠ 酶37℃酶切2.5 h，電泳19 h 后，用GelRed 染色，于凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)通過(guò)Excel軟件和SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。運(yùn)用 BioNumerisc 7.6 軟件進(jìn)行處理和聚類分析，相似度系數(shù)設(shè)置為Dice，容許度設(shè)置1.5%，采用非加權(quán)平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGM）行聚類分析并且繪制聚類圖。

2 結(jié)果

2.1 血清分型結(jié)果

在33 株食源性沙門氏菌中，鼠傷寒沙門氏菌有15 株，占比46%，德爾卑沙門氏菌有7 株，占比21%，嬰兒沙門氏菌有5 株，占比15%，腸炎沙門氏菌4 株，占比12%，肯塔基沙門氏菌2 株，占比6%。

本次實(shí)驗(yàn)菌株數(shù)量占比最高的為鼠傷寒沙門氏菌（15 株）與德爾卑沙門氏菌（7 株），屬于本次實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)菌株。

2.2 PFGE 分子分型結(jié)果

2.2.1 食源性沙門氏菌PFGE 分子分型結(jié)果

33 株食源性沙門氏菌經(jīng)過(guò)PFGE 分子分型，僅有29 株條帶可經(jīng)BioNumerics 軟件進(jìn)行分析，剩余菌株共得出24 種條帶類型，對(duì)其用P1-P24 編號(hào)。

通過(guò)聚類分析菌株總相似度為56.4%，其中完全相同的有4 組，分別是P5 條帶（11、12，血清型均為嬰兒沙門氏菌）、P15 條帶（8、9、10，血清型均為鼠傷寒沙門氏菌）、P20 條帶（1、4，血清型均為德爾卑沙門氏菌）以及P24 條帶（13、16，血清型均為腸炎沙門氏菌），如圖1 所示。

圖1 29 株沙門氏菌聚類分析

優(yōu)勢(shì)帶型P15 包含3 株菌，P5、P20 以及P24均包含2 株菌，其余20 種帶型各包含1 株菌（若相似度高達(dá)100%，則視為同一PFGE 型，即PFGE圖譜完全一致，同一帶型在圖譜中呈現(xiàn)相對(duì)較多的菌株帶型稱為優(yōu)勢(shì)帶型）。在相似度100%的條帶中，P5 帶型的11 與12 號(hào)均為2017 年檢出，且血清型結(jié)果均為嬰兒沙門氏菌，推測(cè)其來(lái)源為同一株菌，同理P15 帶型，P20 帶型也均來(lái)源于同一株菌。P24帶型的腸炎沙門氏菌，一株于2015 年（16）檢出，一株于2016 年（13）檢出。推測(cè)造成2015 年食源性事故的污染源并未完全清除，傳播途徑未切斷，導(dǎo)致其在2016 年再次造成危害。

2.2.2 優(yōu)勢(shì)血清型鼠傷寒沙門氏菌PFGE 聚類結(jié)果分析

15 株鼠傷寒沙門氏菌分型分為10 種帶型（其中3 株菌所出條帶顏色對(duì)比暗淡，難以上機(jī)分析，原因可能是此次使用的Xba 1 酶不適用或者是所用蛋白酶K 存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，效能減退），其中優(yōu)勢(shì)帶型P15 占25%（3/12），剩余9 種帶型占75%（9/12）。

2.2.3 優(yōu)勢(shì)血清型德爾卑沙門氏菌PFGE 聚類結(jié)果分析

7 株德爾卑沙門氏菌分型為5 種帶型（其中1株菌所出條帶顏色暗淡，難以上機(jī)分析，原因可能與無(wú)法分析的3 株鼠傷寒沙門氏菌一致），其中優(yōu)勢(shì)帶型P20占33.3%（2/6），其余帶型占66.7%（4/6）。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)鼠傷寒沙門氏菌與德爾卑沙門氏菌為優(yōu)勢(shì)菌株，與江西優(yōu)勢(shì)菌株為鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌的結(jié)論基本相同[11]，與聊城市的結(jié)果存在一定差別[12]，表明不同來(lái)源的菌株血清型別存在一定差異。

通過(guò)PFGE 技術(shù)對(duì)2015 年至2020 年貴陽(yáng)市29株食源性沙門氏菌進(jìn)行分子分型，所獲條帶經(jīng)BioNumerics 軟件進(jìn)行處理，根據(jù)條帶數(shù)量以及位置的不同將29 株沙門氏菌分出24 種帶型。聚類顯示條帶總相似度為56.4%～100%，結(jié)果呈現(xiàn)多態(tài)性。優(yōu)勢(shì)血清型存在明顯優(yōu)勢(shì)帶型，12 株鼠傷寒沙門氏菌有10 種帶型，優(yōu)勢(shì)帶型為P15 型；6 株德爾卑沙門氏菌有5 種帶型，優(yōu)勢(shì)帶型為P20。相同帶型中，腸炎沙門氏菌（13，16）分別為2015 年與2016 年檢出，提示貴陽(yáng)市可能存在對(duì)部分沙門氏菌傳播源清除不徹底，傳播途徑并未完全切斷的問(wèn)題，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)所有已發(fā)生沙門氏菌傳播源進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，做好防控措施。

此外，因沙門氏菌引起的感染多以散發(fā)形式報(bào)告的，甚至很多情況下未對(duì)該致病菌進(jìn)行檢測(cè)，但通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)部分散發(fā)病例有一定的聚集傾向，因此及時(shí)做好食物中毒患者、醫(yī)院腹瀉患者和食品監(jiān)測(cè)中的病原菌分離鑒定工作并及時(shí)開展 PFGE分型有利于及時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)并控制潛在食源性疾病暴發(fā)。