徐園園，李 靜，王 敏，焦梅珍，王 靜，黃佳翔，蘇 琪，劉冬梅，宋 旸，洪權(quán)春

（商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院 河南省干制辣椒產(chǎn)業(yè)技術(shù)院士工作站，河南 商丘 476000）

辣椒富含辣椒堿、辣椒紅素、維生素C、礦物質(zhì)、核黃素、硫胺素等成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。發(fā)酵能夠提高辣椒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和貯藏性能。我國(guó)傳統(tǒng)的辣椒醬采用高鹽發(fā)酵，再用水洗法去除多余鹽分，水洗會(huì)造成辣椒維生素C等營(yíng)養(yǎng)成分的流失。而采用接種乳酸菌發(fā)酵的方法可以彌補(bǔ)這些不足[2]，并且乳酸菌具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收和調(diào)節(jié)胃腸道菌群等多種功能[3]。乳酸菌發(fā)酵果蔬能夠提高其抗氧化活性、具有降血糖作用，還能提高果蔬制品的貯藏性能[4]。

目前，用于發(fā)酵果蔬的乳酸菌菌株多為來自乳制品的商用乳酸菌[5]。然而許多消費(fèi)者認(rèn)為商用乳酸菌發(fā)酵的蔬菜制品，會(huì)失去其傳統(tǒng)的、特有的味道和氣味[6]。開發(fā)辣椒發(fā)酵專用乳酸菌菌株對(duì)辣椒發(fā)酵工業(yè)具有重要的意義。前人對(duì)辣椒發(fā)酵微生物的研究主要集中在菌種分離純化、辣椒發(fā)酵工藝優(yōu)化、風(fēng)味調(diào)配以及風(fēng)味物質(zhì)分析等方面。沙漠等[7-9]均從自然發(fā)酵的辣椒醬中分離出產(chǎn)酸量高、生長(zhǎng)良好、耐鹽性高、適用于辣椒醬發(fā)酵的乳酸菌菌株；徐清萍等[10-11]通過改變接種量、調(diào)節(jié)甜味劑用量、加鹽量、發(fā)酵時(shí)間等工藝改善發(fā)酵辣椒醬品質(zhì)，并采用不同乳酸菌組合發(fā)酵辣椒醬，結(jié)果表明復(fù)合乳酸菌發(fā)酵有利于降低發(fā)酵產(chǎn)品亞硝酸鹽含量；楊玉新等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌和其他發(fā)酵微生物按一定比例組合形成復(fù)合菌來發(fā)酵辣椒效果更好。然而，以三櫻椒（Capsicum annuum）作為原材料進(jìn)行乳酸菌分離的研究尚未見報(bào)道。

本研究利用本地特色辣椒三櫻椒（Capsicum annuum）進(jìn)行自然發(fā)酵，采用鈣溶圈法從中分離乳酸菌菌株，通過形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，并對(duì)分離菌株的生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸能力和耐酸性能進(jìn)行分析，以期篩選出適合三櫻椒發(fā)酵的乳酸菌菌株，為三櫻椒發(fā)酵工業(yè)提供后備菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

辣椒：選取本校試驗(yàn)田中產(chǎn)量好、辣度高的三櫻椒品系19CL75作為發(fā)酵材料。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基[9]：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸膏10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 mL/L，乙酸鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。MRS固體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉20 g/L。

1.1.3 試劑

2×TaqMaster Mix聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）預(yù)混液、細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、瓊脂糖（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀（均為生化試劑）：生工生物工程（上海）股份有限公司；DL2 000 DNA Marker、6×Loading Buffer：寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHZ-2112恒溫培養(yǎng)箱、HZP-150恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；H1650-W高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-7502PCS紫外可見分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；Eppendorf Mastercycler nexus PCR儀：德國(guó)Eppendorf公司；JS6800凝膠成像分析系統(tǒng)一體機(jī)：上海培清科技有限公司；PHSJ-3F型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 辣椒醬發(fā)酵工藝流程

新鮮三櫻椒→選擇→預(yù)處理→清洗→晾干→打漿→配料→混勻→裝壇→室溫發(fā)酵→成品

操作要點(diǎn)：選擇無病害無損傷的新鮮紅辣椒5 kg，去除辣椒果梗，清洗干凈，晾干備用。將辣椒用攪拌機(jī)打碎，同時(shí)添加5%食鹽、5%白糖、4%大蒜末、6%生姜末攪拌均勻，裝瓶，室溫發(fā)酵20 d。

1.3.2 乳酸菌的分離純化

取發(fā)酵完成的辣椒醬1 g加入10 mL無菌水中，混勻，用無菌水按10倍梯度稀釋至10-7；取稀釋好的辣椒醬液體0.2 mL，均勻涂布于含2%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下倒置培養(yǎng)3 d。挑取生長(zhǎng)較好、有溶鈣圈的單菌落在MRS固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)進(jìn)行菌落純化，重復(fù)純化3次，得到單菌落，觀察培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)特征，并將單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，于100倍的油鏡下觀察。

1.3.3 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

挑取分離純化后的菌株，加入5 mL MRS液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以其為模板，采用細(xì)菌16S rDNA引物Bak4（5'-AGGAGGTGATCCARCCGCA-3'）和Bak11（5'-AGTATTGATCMTGGCTCAG-3'）[14]對(duì)菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：基因組DNA（150 μmol/L）1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，加雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行序列同源性比對(duì)搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

1.3.4 乳酸菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將待測(cè)菌株以3%（V/V）的接種量接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，每3 h取一次樣，采用分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值（OD600nm值）。以培養(yǎng)時(shí)間（x）為橫坐標(biāo)，OD600nm值（y）為縱坐標(biāo)繪制菌株生長(zhǎng)曲線[16]。

1.3.5 乳酸菌產(chǎn)酸能力的測(cè)定

將待測(cè)菌株以3%（V/V）的接種量接種裝液量為100 mL/250 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，每3 h測(cè)定一次發(fā)酵液的pH值。

1.3.6 乳酸菌耐酸性能的測(cè)定

將待測(cè)菌株以3%（V/V）的接種量分別接種于pH值為2.0、3.0、4.0的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，每5 h取一次樣，采用分光光度計(jì)測(cè)OD600nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒醬中乳酸菌的分離和純化

利用含有2%的CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基從自然發(fā)酵辣椒醬中共分離純化得到19株形態(tài)、顏色和大小不同、具有溶鈣圈的菌株，其菌落及細(xì)胞形態(tài)見表1。

表1 分離菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)Table 1 Colony and cell morphology of isolated strain

由表1可知，根據(jù)菌落及細(xì)胞形態(tài)，將19株分離菌株歸為4類，菌落呈圓形，邊緣整齊，呈乳白色、白色或者淺黃色；均為革蘭氏陽(yáng)性菌。細(xì)胞呈短桿狀，單個(gè)或短鏈形狀排列，彎曲。初步斷定為乳酸菌。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

采用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1。

圖1 19株分離菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products of 19 isolated strains

由圖1可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度均在1 000～2 000 bp之間，與預(yù)期結(jié)果相符?；?6S rDNA基因序列構(gòu)建19株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 基于16S rDNA基因序列19株分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 19 isolated strains based on the 16S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株P(guān)LT-1、PL-1、PLP-1等16個(gè)菌株與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）聚于一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近，菌株P(guān)L-4、PL-5、PL-6與赫輪魏斯氏菌（Weissella hellenica）聚于一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定菌株P(guān)L-4、PL-5、PL-6為赫輪魏斯氏菌（Weissella hellenica），其余菌株均為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.3 乳酸菌菌株的生長(zhǎng)曲線

19株菌株在MRS液體培養(yǎng)中的生長(zhǎng)曲線見圖3。由圖3可知，16個(gè)植物乳桿菌生長(zhǎng)情況相似，3個(gè)希臘魏斯氏菌生長(zhǎng)情況相似。所有菌株在培養(yǎng)3 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)18 h后進(jìn)入平臺(tái)期。比較兩個(gè)不同菌種的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)初期3個(gè)赫輪魏斯氏菌菌株生長(zhǎng)較快，但是培養(yǎng)12 h后生長(zhǎng)速度減慢，培養(yǎng)18 h后這3個(gè)菌株的OD600nm值均低于植物乳桿菌菌株。說明赫輪魏斯氏菌和植物乳桿菌的生長(zhǎng)模式不同，赫輪魏斯氏菌在培養(yǎng)后期生長(zhǎng)較慢。

圖3 19株分離菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of 19 isolated strains

2.4 乳酸菌菌株產(chǎn)酸能力的分析

19株乳酸菌發(fā)酵過程中pH值的變化見圖4。由圖4可知，菌株P(guān)LP-1發(fā)酵液的pH值下降最快，其他菌株在發(fā)酵6 h前pH值下降速率相似，而發(fā)酵6 h后，菌株P(guān)L-4、PL-5、PL-6發(fā)酵液的pH值下降速度變慢，培養(yǎng)21 h后pH值不再下降，最終這3個(gè)菌株發(fā)酵液的pH值穩(wěn)定在4.3左右，而其他植物乳桿菌菌株發(fā)酵液的pH值穩(wěn)定在3.7左右。綜上，植物乳桿菌的產(chǎn)酸能力比赫輪魏斯氏菌好，且在所有菌株中植物乳桿菌PLP-1產(chǎn)酸性能最好可用于辣椒醬發(fā)酵。

圖4 19株分離菌株發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.4 Change of pH of 19 isolated strains during fermentation

2.5 乳酸菌菌株耐酸能力的分析

本研究分別從植物乳桿菌中挑取3株菌株（PLP-1、PLT-1和PLA-4），從赫輪魏斯氏菌中挑取2株菌株（PL-4和PL-6）進(jìn)行耐酸能力分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，當(dāng)pH為2.0時(shí)，5個(gè)菌株的生長(zhǎng)均受到嚴(yán)重抑制；當(dāng)pH值為3.0時(shí)，菌株P(guān)L-4和PL-6的生長(zhǎng)仍然受到嚴(yán)重抑制，3株植物乳桿菌有所生長(zhǎng)，OD600nm值最高達(dá)到0.6，其中植物乳桿菌PLP-1生長(zhǎng)最好；當(dāng)pH值為4.0時(shí)，兩種菌的生長(zhǎng)差異非常顯著，菌株P(guān)L-4和PL-6生長(zhǎng)仍然受到嚴(yán)重抑制，但3株植物乳桿菌菌株的生長(zhǎng)較好，OD600nm值最高能達(dá)到1.2，其中植物乳桿菌PLT-1生長(zhǎng)最好。綜上所述，植物乳桿菌的耐酸性比赫輪魏斯氏菌好，且植物乳桿菌PLP-1的耐酸性最好。

圖5 5株乳酸菌菌株耐酸性的測(cè)定結(jié)果Fig.5 Determination results of acid tolerance of 5 strains of lactic acid bacteria

3 討論

隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品提出了更高的需求，在營(yíng)養(yǎng)美味的前提下還要求健康。辣椒醬工業(yè)的發(fā)展也應(yīng)該向更健康、更美味的方向發(fā)展。辣椒醬的研究應(yīng)該集中在以下2個(gè)方面：第一，從高鹽發(fā)酵向低鹽發(fā)酵發(fā)展，鹽分的過量不僅破壞食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且影響人們的健康，因此，應(yīng)該研究更健康的低鹽發(fā)酵技術(shù)。第二，從自然發(fā)酵辣椒醬向人工接種發(fā)酵菌方向發(fā)展，開發(fā)出適合辣椒醬發(fā)酵的工程菌株，并且開發(fā)復(fù)合菌種發(fā)酵技術(shù)，利用乳酸菌、酵母菌等多種發(fā)酵菌來改善發(fā)酵辣椒醬的品質(zhì)和風(fēng)味。

本研究從自然發(fā)酵辣椒醬中分離出19株乳酸菌菌株，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，其中，16株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），3株為赫輪魏斯氏菌（Weissella hellenica）。植物乳桿菌是革蘭氏陽(yáng)性菌株，菌體形態(tài)有圓端短桿狀、彎桿狀和鏈狀3種，常見于泡菜、酵素和酸奶等發(fā)酵食品中，可以有效改善腸胃環(huán)境[17-18]。赫輪魏斯氏菌屬于魏斯氏菌屬，在食品發(fā)酵過程中的作用主要體現(xiàn)在兩方面：一方面對(duì)食品中風(fēng)味物質(zhì)如有機(jī)酸、酯類及短鏈脂肪酸等的合成具有重要作用，另一方面魏斯氏菌屬的有些菌株具有合成細(xì)菌素、低聚糖、胞外多糖和纖維素等特性，具有潛在的益生菌特性[19-21]，目前，關(guān)于其在果蔬發(fā)酵中的研究報(bào)道較少。有研究表明，乳桿菌屬和魏斯氏菌屬均為發(fā)酵辣椒中的優(yōu)勢(shì)菌屬[22]。目前，從辣椒發(fā)酵產(chǎn)品中分離得到的乳酸菌主要為植物乳桿菌[7，16，23]，尚未見到從辣椒發(fā)酵產(chǎn)品中分離出赫輪魏斯氏菌的報(bào)道。

本研究測(cè)定了19株乳酸菌菌株的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酸性能，結(jié)果表明，植物乳桿菌和赫輪魏斯氏菌的生長(zhǎng)特性不同，植物乳桿菌前期生長(zhǎng)較慢，但培養(yǎng)12 h后植物乳桿菌生長(zhǎng)速度超過了赫輪魏斯氏菌，且最終OD600nm值比赫輪斯氏菌高。植物乳桿菌和魏斯氏菌的產(chǎn)酸性能也不同，在培養(yǎng)6 h前，植物乳桿菌和赫輪魏斯氏菌發(fā)酵液的pH值下降速率相似，而發(fā)酵6 h后，植物乳桿菌發(fā)酵液pH下降速率比赫輪魏斯氏菌快，最終植物乳桿菌發(fā)酵液的pH值穩(wěn)定在3.5，而赫輪魏斯氏菌發(fā)酵液的pH值穩(wěn)定在4.3，說明植物乳桿菌產(chǎn)酸能力比希臘魏斯氏菌好。耐酸性研究表明，在pH＜4.0的培養(yǎng)基中赫輪魏斯氏菌的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，而植物乳桿菌在pH為4.0和3.0的MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到的抑制較小。有報(bào)道稱食竇魏斯氏菌在發(fā)酵泡菜時(shí)pH下降比植物乳桿菌快，而且可以和植物乳桿菌協(xié)同作用促進(jìn)泡菜的發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味更好，新增了7種揮發(fā)性物質(zhì)[24]，本研究結(jié)果表明發(fā)酵前期赫輪魏斯氏菌發(fā)酵液pH下降較快，但發(fā)酵后期植物乳桿菌發(fā)酵液pH下降較快。有研究表明，在果蔬發(fā)酵食品中，魏斯氏菌是發(fā)酵初期的優(yōu)勢(shì)菌群，并具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在發(fā)酵的后期被乳桿菌所替代[25]，這與本研究結(jié)果相符。由此推測(cè)在果蔬發(fā)酵前期pH值較高，赫輪魏斯氏菌生長(zhǎng)較快為優(yōu)勢(shì)菌群，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液pH值逐漸降低，赫輪魏斯氏菌的耐酸能力較弱，生長(zhǎng)變慢，植物乳桿菌的耐酸性好因此取代魏斯氏菌成為優(yōu)勢(shì)菌群[26]。

4 結(jié)論

采用溶鈣圈法從自然發(fā)酵三櫻椒中共分離出19株乳酸菌菌株，經(jīng)分子生物技術(shù)鑒定，其中16株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），3株為赫輪魏斯氏菌（Weissella hellenica）。生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明，植物乳桿菌前期生長(zhǎng)較慢，但培養(yǎng)12 h后生長(zhǎng)速度優(yōu)于赫輪魏斯氏菌，且最終OD600nm值比赫輪魏斯氏菌高。產(chǎn)酸能力分析結(jié)果表明，16株植物乳桿菌產(chǎn)酸能力比3株赫輪魏斯氏菌好，且植物乳桿菌PLP-1最好。耐酸性分析結(jié)果表明，16株植物乳桿菌的耐酸性比3株赫輪魏斯氏菌好，且植物乳桿菌PLP-1最好。