趙文英，薛 穎，花 錦，張志瑞，王 蓉，楊潤璐，王立敏

（1.中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西太原 030051；2.中華人民共和國太原海關(guān)，山西太原 030001）

樹莓是薔薇科懸鉤子屬的一種落葉灌木的聚合漿果。樹莓富含多種抗氧化活性成分，被譽(yù)為“第三代黃金水果”[1-2]。樹莓果酒顏色艷麗、香氣濃郁、口感獨(dú)特，作為一種新型的健康商業(yè)飲品正在興起[3]。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是果酒酒精發(fā)酵的主導(dǎo)微生物[4-5]。在發(fā)酵過程中，釀酒酵母的生長(zhǎng)代謝會(huì)引起果酒中各種物質(zhì)組分的變化，從而影響著果酒的品質(zhì)[6-9]。樹莓中有機(jī)酸含量高，且檸檬酸比重大，導(dǎo)致紅樹莓果酒產(chǎn)品口感不佳。生物降酸是指微生物以有機(jī)酸為碳源，利用并分解，從而達(dá)到降酸目的。在果酒釀造中，通常采用蘋果酸乳酸發(fā)酵法來降酸，但不能對(duì)檸檬酸起到降酸效果。有研究表明，有些釀酒酵母菌可以通過相關(guān)代謝降解有機(jī)酸[8]。陳思睿等[10-11]對(duì)紅樹莓果園土壤和鮮果上的微生物進(jìn)行分離純化，篩選出具有較強(qiáng)降解檸檬酸能力的菌株，這些菌株經(jīng)鑒定均屬于非釀酒酵母，其被推薦應(yīng)用于紅樹莓果汁的降酸處理。目前，商業(yè)釀酒酵母對(duì)樹莓有機(jī)酸組成影響的研究較少。

樹莓果酒中的酚類物質(zhì)在感官質(zhì)量、抗氧化活性等方面發(fā)揮著重要影響[12-13]，它可分為花色苷酚和非花色苷酚[13]。樹莓果酒的一個(gè)重要特點(diǎn)是顏色靚麗，但在存貯過程中，顏色容易加深褐化。果酒的視覺特性主要是由花色苷酚引起的，但花色苷酚與非花色苷酚類物質(zhì)的相互作用對(duì)視覺的影響更為重要[14-16]。另外，非花色苷酚還會(huì)對(duì)果酒口感特征也產(chǎn)生重要影響[14]。

以往樹莓果酒釀酒酵母的篩選研究多集中在理化指標(biāo)、抗氧化活性、香氣分析上[11-12，17-18]，對(duì)有機(jī)酸和非花色苷酚物質(zhì)影響的研究報(bào)道較少。該實(shí)驗(yàn)采用山西地區(qū)的秋福樹莓凍果為原料，考察了5種商業(yè)釀酒酵母對(duì)樹莓果酒發(fā)酵曲線、理化指標(biāo)、有機(jī)酸組分及非花色苷單體酚組分及感官指標(biāo)的影響，以篩選出能體現(xiàn)樹莓原料特征的釀酒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秋福樹莓：2020年9月在山西省繁峙縣大木瓜村采集（成熟度超過80%）；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CECA、BV818：湖北安琪酵母股份有限公司；釀酒酵母71B：煙臺(tái)帝伯仕貿(mào)易有限公司；釀酒酵母VP5、Montrachet：意大利VASON公司Color果膠酶（酶活30 000 U/g）：德國AB酶試劑公司。

有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)物：草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜純）；單體酚的標(biāo)準(zhǔn)物：原花青素、香草酸、水楊酸、鞣花酸、沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、山奈酚、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）；上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenyl，DPPH）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-1260Ⅱ型高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司；Innoval ASB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和NH2色譜柱（9 mm×250 mm，4.6 μm）：美國色譜科公司；QTRAP 4500 LC/MS液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國AB SCIEX公司；Thermo Hypersil GOLD C18液相色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）：美國熱電公司；WGZ-200濁度儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樹莓果酒的釀制

樹莓凍果自然解凍后，加入保護(hù)劑偏重亞硫酸氫鉀（30 mg/L）破碎；加入Color果膠酶30 mg/kg，在50 ℃條件下進(jìn)行酶解1.5 h，每30 min攪拌一次；酶解浸漬結(jié)束后，迅速降溫，并壓榨出汁；在4～5 ℃條件下，靜置沉淀24 h后，將清汁分離，測(cè)清汁的酸度、糖度、pH；配制碳酸氫鉀母液（100 g/L），調(diào)節(jié)pH至3.2；加入葡萄糖，調(diào)整起始糖度為21 °Bx。均質(zhì)化后的果汁分裝到5 L玻璃瓶中，控制溫度于15～18 ℃儲(chǔ)藏?；罨虡I(yè)酵母（VP5、Montrachet、71B、BV818、CECA）按200 mg/L接種，并加入200 mg/L營養(yǎng)劑，啟動(dòng)發(fā)酵；每天監(jiān)測(cè)兩次pH、糖度、溫度；待發(fā)酵徹底結(jié)束，倒罐，加入50 mg/L的偏重亞硫酸氫鉀，密閉低溫陳釀三個(gè)月后取樣檢測(cè)，期間倒罐一次。

1.3.2 發(fā)酵曲線繪制

發(fā)酵曲線是用來表示微生物發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)情況，每12 h測(cè)一次糖度，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以果酒糖度為縱坐標(biāo)，繪制發(fā)酵曲線。

1.3.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

pH、可滴定酸、殘?zhí)堑戎笜?biāo)的測(cè)定參考GB/T 15038—2006《葡萄酒果酒分析方法》；乙醇含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[5]；色度以酒樣在波長(zhǎng)420 nm、520 nm、620 nm處吸光度值加和來表示；濁度使用WGZ-200濁度儀測(cè)定；總酚含量采用Folin酚比色法測(cè)定，結(jié)果以mg沒食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）/L表示[19]；DPPH自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]；糖度用手持糖度計(jì)測(cè)定。

1.3.4 高效液相色譜測(cè)定有機(jī)酸和甘油

酒樣品8 000×g離心5 min后，用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行分析。采用Innoval ASB C18色譜柱分離有機(jī)酸，流動(dòng)相為0.1 mol/L H3PO4，流速1.0 mL/min，總運(yùn)行時(shí)間7 min，紫外-可見光譜檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

甘油測(cè)定采用NH2柱（9 mm×250 mm，4.6 μm），使用流動(dòng)相為乙腈∶水（85∶15，V/V），流速為1.0 mL/min，采用RI-II檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。樣品需用流動(dòng)相稀釋10倍。樣品進(jìn)行3次平行測(cè)定[20]。

1.3.5 高效液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定非花色苷單體酚

10 mL樹莓果酒樣品分別在pH 7.0和pH 2.0條件下用120 mL乙酸乙酯分六次提取。提取液混合后，采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)干燥，溫度設(shè)置35 ℃。干殘?jiān)?0 mL甲醇溶解后，通過0.22 μm有機(jī)膜過濾后進(jìn)入高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)。色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），進(jìn)樣量為5 μL。流動(dòng)相A、B分別為0.1%甲酸水和乙腈，流速為0.30 mL/min。單體酚分離梯度程序?yàn)? min，5%；0.5 min，5%；2 min，95%；4 min，95%；1 min，5%；5 min，5%。采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）負(fù)離子模式對(duì)12種單體酚進(jìn)行了質(zhì)譜分析。毛細(xì)管源溫度為600 ℃，護(hù)套氣體流量為60 m3/h，輔助氣體流量為10 m3/h，噴霧電壓設(shè)置為5 500 V。光譜在100～1 000 m/z全掃描模式下獲得。使用標(biāo)準(zhǔn)溶液在6種不同濃度下的峰面積校準(zhǔn)曲線計(jì)算出所有單體酚的含量，并以μg/L表示[21]。

1.3.6 樹莓果酒感官質(zhì)量評(píng)分

感官指標(biāo)主要是通過視覺、嗅覺、味覺、觸覺對(duì)酒樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，包括顏色、香氣、滋味、口感、典型性5個(gè)方面[18]。每個(gè)指標(biāo)得分以10分計(jì)，得分標(biāo)準(zhǔn)：極端不舒服（1分）；非常不舒服（2分）；中度不舒服（3分）；輕微不舒服（4分）；無好無壞（5分）；輕微舒服（6分）；中度舒服（7分）；非常舒服（8分）；極度舒服（9分）；完美（10分）；由學(xué)院20名具有專業(yè)知識(shí)的人員，對(duì)酒樣進(jìn)行感官評(píng)分。對(duì)應(yīng)感官評(píng)價(jià)得分以平均值計(jì)，滿分50分。

1.3.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析

所有的試驗(yàn)均做3次重復(fù)，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（n=3）。所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS version 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Origin8.0軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同釀酒酵母菌的發(fā)酵曲線

不同釀酒酵母菌的發(fā)酵曲線可反映出酵母菌的啟動(dòng)、發(fā)酵速率和發(fā)酵周期情況，是衡量酵母發(fā)酵能力的重要方法[4]。整個(gè)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)保持15～18 ℃低溫環(huán)境下進(jìn)行，不同釀酒酵母菌的發(fā)酵曲線圖見圖1。

圖1 不同釀酒酵母菌的發(fā)酵曲線Fig.1 Fermentation curves of different Saccharomyces cerevisiae strains

由圖1可知，釀酒酵母CECA和71B耐受性強(qiáng)，發(fā)酵啟動(dòng)快速，24 h后進(jìn)入旺盛發(fā)酵期，發(fā)酵速率快且發(fā)酵周期短；菌株CECA通常用于紅葡萄酒的釀造，發(fā)酵能力強(qiáng)，菌株71B為降酸酵母。菌株Montrachet與BV818發(fā)酵的酒樣啟動(dòng)快速，24 h后開始進(jìn)入旺盛發(fā)酵期，后期發(fā)酵速率緩和有力，發(fā)酵徹底，發(fā)酵周期適中；這兩菌株通常為白葡萄酒推薦使用菌株。從后期成品酒的感官評(píng)分看，更適合樹莓果酒發(fā)酵。而且，菌株Montrachet被認(rèn)為是一種非常好的適合大多數(shù)水果使用的釀酒酵母[4]。菌株VP5啟動(dòng)最為緩慢，72 h后進(jìn)入旺盛發(fā)酵期，180 h后發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵周期最長(zhǎng)。

2.2 不同酵母對(duì)樹莓果酒發(fā)酵基礎(chǔ)指標(biāo)的影響

2.2.1 理化指標(biāo)分析

五株釀酒酵母發(fā)酵所得樹莓果酒的理化指標(biāo)見表1。由表1可知，不同釀酒酵母在pH、可滴定酸、殘?zhí)恰⒕凭鹊确矫娑即嬖陲@著性差異（P＜0.05）。菌株71B和Montrachet發(fā)酵的酒樣pH高于其他菌株，菌株71B是用于葡萄酒降酸的釀酒酵母，但在樹莓果酒中，并沒有表現(xiàn)出明顯的降酸優(yōu)勢(shì)，可能與兩者有機(jī)酸組成組分不同有關(guān)，而Montrachet的降酸能力卻值得進(jìn)一步分析。所有酒樣的殘?zhí)呛慷迹? g/L，其中殘?zhí)橇孔畲蟆⒕凭容^低的是菌株BV818，說明樹莓果汁的低酸環(huán)境對(duì)BV818的發(fā)酵能力有一定影響，而殘?zhí)禽^低、酒精度較高的是菌株Montrachet和CECA。同時(shí)，菌株Montrachet具有較強(qiáng)的產(chǎn)甘油的能力，其甘油含量最高，為8.22 g/L，顯著高于其他四個(gè)酒樣（P＜0.05）。甘油是果酒釀造中一種非常重要的副產(chǎn)物，具甜味和油性的感官特性，對(duì)于平衡果酒風(fēng)味具有重要作用，低溫、高酸的發(fā)酵條件有利于酵母菌在發(fā)酵過程中生成甘油[4]。從總酚和抗氧化性的角度看，菌株Montrachet發(fā)酵的酒樣與菌株71B、CECA發(fā)酵的酒樣無顯著差異（P＞0.05），均表現(xiàn)出較高的總酚含量和抗氧化活性?？偡訖z測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的樹莓總酚范圍1.5～3.0 g/L相符[21]。菌株VP5的總酚含量和抗氧化活性均顯著低于其他菌株（P＜0.05），可能與其酒泥凝聚沉淀能力強(qiáng)有關(guān)。從上述理化指標(biāo)分析結(jié)果來看，菌株Montrachet在發(fā)酵樹莓果酒的過程中表現(xiàn)最佳，具有一定的降酸能力，發(fā)酵徹底，酒精度高，且具有較強(qiáng)的甘油生產(chǎn)能力，其總酚含量和抗氧化活性高。

表1 不同釀酒酵母菌樹莓果酒的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of raspberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains

2.2.2 有機(jī)酸比較

有機(jī)酸的含量在一定程度上影響著葡萄酒的風(fēng)味平衡、化學(xué)穩(wěn)定性、pH值，從而影響著果酒的質(zhì)量[23]。不同釀酒酵母樹莓果酒中的部分有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果見表2。

由表2可知，樹莓果酒中最主要的有機(jī)酸是檸檬酸，約占總酸含量的90%；其次是蘋果酸、乳酸、抗壞血酸、酒石酸等，酒樣中未檢出琥珀酸，測(cè)定結(jié)果與PONDER A等[1]的檢測(cè)結(jié)果（檸檬酸17.2 g/L，蘋果酸0.46 g/L）接近。發(fā)酵能力最強(qiáng)的菌株CECA發(fā)酵酒樣總酸值最大，檸檬酸占比最高，且菌株CECA代謝會(huì)造成蘋果酸、乳酸、醋酸含量顯著升高（P＜0.05）。適合白葡萄酒釀造的菌株BV818和Montrachet發(fā)酵所得酒樣總酸值較小，且蘋果酸含量顯著低于其他3個(gè)樣品（P＜0.05），所有樣品的酒石酸含量無顯著差異（P＞0.05）。MENA P等[22]報(bào)道了石榴酒發(fā)酵過程中有機(jī)酸的變化，研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸和酒石酸含量沒有變化，而蘋果酸在釀造過程中顯著增加。王博[24]在優(yōu)選藍(lán)莓釀酒酵母時(shí)，分析了四種釀酒酵母對(duì)藍(lán)莓果酒有機(jī)酸的動(dòng)態(tài)影響，發(fā)現(xiàn)檸檬酸在發(fā)酵過程中降低幅度最大，使得成品藍(lán)莓酒中基本檢測(cè)不出檸檬酸，而蘋果酸含量卻大幅增加，為起始含量的4倍。菌株Montrachet發(fā)酵酒樣發(fā)酵速率平緩，總酸值最少，檸檬酸和蘋果酸含量最低。在保持酒樣糖酸平衡方面，具有明顯優(yōu)勢(shì)。

表2 不同釀酒酵母菌樹莓果酒中的有機(jī)酸成分Table 2 Organic acid ingredient of raspberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains

2.2.3 不同釀酒酵母菌樹莓果酒中單體酚含量比較

果酒中的非花色苷酚類物質(zhì)在感官品質(zhì)、抗氧化活性等方面發(fā)揮著重要影響[13]，不同釀酒酵母樹莓果酒中單體酚的含量測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 不同釀酒酵母菌樹莓果酒中單體酚的含量Table 3 Mono-phenol contents of raspberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains

結(jié)果表明，該研究共定量檢測(cè)了樹莓酒中11種非花色苷單體酚，各酒樣中槲皮素含量最高，其次是鞣花酸、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素等。從各類單體酚的總量來看，酚酸類約占總含量的50.2%，黃酮醇類32.5%，黃烷醇類17.3%。JELENA J等[25]通過高效液相色譜法測(cè)定樹莓多酚的檢測(cè)結(jié)果顯示，表兒茶素含量最高。郭雪[13]提出樹莓果肉中最豐富的非花色苷酚是黃酮醇類和酚酸類。YANG J等[21]認(rèn)為鞣花酸單寧是樹莓中含量較高的重要功能成分，這與本研究檢測(cè)結(jié)果基本保持一致。

從酚酸總值看，菌株BV818和Montrachet發(fā)酵的酒樣中含量最高，其中鞣花酸和沒食子酸含量顯著高于其他樣品（P＜0.05）。在低溫環(huán)境下，這兩菌株的發(fā)酵速率平緩，可能有利于小分子酚酸物質(zhì)的溶出。有研究表明，這些小分子酚酸物質(zhì)具有較強(qiáng)的輔色能力，因?yàn)槟鼙Ｗo(hù)花青素在黃酮離子的C2位置不被親核分子攻擊，從而促進(jìn)更高的顏色穩(wěn)定性[28]。ZHANG X K等[29]提出酚酸類中的鞣花酸與沒食子酸對(duì)果酒的花色苷有護(hù)色、增強(qiáng)穩(wěn)定性的作用。

黃烷醇類是樹莓果酒苦澀味的物質(zhì)基礎(chǔ)，能夠影響到果酒的口感[14，27]。由表3可知，發(fā)酵力強(qiáng)的菌株CECA和71B具有較強(qiáng)的黃烷醇類物質(zhì)的浸提能力。而菌株Montrachet和BV818發(fā)酵的樣品中黃烷醇類含量居中。這也可能是Montrachet和BV818酒樣由于適當(dāng)?shù)狞S烷醇含量，而在感官品評(píng)中能獲得較高分值的一個(gè)原因。而VP5黃烷醇類物質(zhì)含量最小，不利于形成豐富的口感，從而會(huì)影響感官評(píng)分。非花色素苷酚中的黃酮類物質(zhì)無明顯規(guī)律性變化，其含量主要影響樹莓酒的顏色[14]。

從總體上看，釀酒酵母Montrachet在低溫發(fā)酵過程中，能整體提升酒樣中酚類物質(zhì)的含量，顯著促進(jìn)了鞣花酸和沒食子酸的釋放，增強(qiáng)了護(hù)色作用，并弱化黃烷醇類物質(zhì)的提取，減少了苦澀感。

2.3 不同釀酒酵母菌樹莓果酒的感官評(píng)價(jià)

由實(shí)驗(yàn)室成員組成評(píng)定小組，對(duì)五種釀酒酵母發(fā)酵所得的果酒樣品進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)價(jià)結(jié)果見圖2。由圖2可知，由五種釀酒酵母發(fā)酵獲得的樹莓果酒在果酒顏色方面，Montrachet和BV818酒樣顏色鮮艷。但在香氣、滋味、口感和典型性方面，Montrachet酒樣評(píng)分都最高。Montrachet酒樣澄清透亮、香氣自然舒適、滋味均衡豐富，酒體圓潤并具有一定的結(jié)構(gòu)感，但沒有強(qiáng)烈的酸澀感，保持了良好的樹莓酒風(fēng)格的典型性。

圖2 不同釀酒酵母樹莓果酒的感官評(píng)價(jià)Fig.2 Sensory evaluation of raspberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains

3 結(jié)論

該研究以秋福樹莓為原料，選用5種不同釀酒酵母發(fā)酵制備樹莓果酒。結(jié)果表明，菌株VP5啟動(dòng)最為緩慢，71B無明顯降酸效果，CECA和BV818感官評(píng)分略低，而酵母菌株Montrachet發(fā)酵樹莓汁啟動(dòng)快速，發(fā)酵速率平緩，發(fā)酵徹底。所得酒樣可滴定酸低，乙醇含量高，殘?zhí)橇康?，甘油含量高，且具有高的總酚含量及抗氧化活性。從有機(jī)酸分析結(jié)果看，釀酒酵母Montrachet具有較強(qiáng)的降低檸檬酸和蘋果酸的能力。從非花色苷單體酚檢測(cè)結(jié)果看，釀酒酵母Montrachet酒樣非花色苷總酚含量最高，其中鞣花酸、沒食子酸等酚酸物質(zhì)含量高，有助于保護(hù)樹莓果酒靚麗的色澤；而黃烷醇酚物質(zhì)含量居中，可避免強(qiáng)烈的苦澀感。故釀酒酵母Montrachet是適合樹莓果酒釀造的優(yōu)良菌株。