鄭文偉，林 軍，林 風，吳麗云

（福建省微生物研究所，福建省紅曲微生物技術開發(fā)應用工程研究中心，福建 福州 350007）

高脂血癥是一種脂質代謝異常疾病，是引起動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的重要因素之一，其表現(xiàn)主要以總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、低密度蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）異常增高及高密度蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）異常降低最為常見[1-3]。隨著人們生活水平的提高及生活方式變化，高脂血癥發(fā)病率也逐年增加[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥患者的心血管疾病發(fā)病率遠高于正常人[5]。他汀類化藥作為降脂的一線用藥，其療效雖顯著，但長期服用后患者易出現(xiàn)不耐受現(xiàn)象、肝損傷等[6-8]，尋求一種更為安全有效的藥物具有重要意義。

功能紅曲（functional red yeast rice，F(xiàn)RYR）以大米為主要原料經(jīng)紅曲霉菌發(fā)酵而來，含莫納克林K（monacolin K，MK）、γ-氨基丁酸等多種生物活性成分，目前，已逐漸被開發(fā)成多種降脂產(chǎn)品，如中成藥血脂康、脂必妥等[9-10]。MK作為FRYR主要降脂活性成分，化學結構雖與洛伐他汀相同[11]，但兩者的藥代動力學特征及生物利用度卻不相同[12]。另外，我國尚缺乏統(tǒng)一紅曲藥材標準，導致各地紅曲藥材質量、臨床給藥劑量差異較大[13-14]，亟需規(guī)范化。

針對以上問題，本研究初步考察能否以MK含量作為FRYR給藥劑量依據(jù)的可行性，并比較FRYR和洛伐他汀對高脂血癥大鼠血脂、肝臟等影響，旨在為今后FRYR進一步的研究、開發(fā)及質量標準提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FRYR：由福建省微生物研究所自產(chǎn)，其MK、桔霉素、黃曲霉毒素含量詳細情況見表1；洛伐他汀片（批號620105018）：山東羅欣藥業(yè)；高脂飼料（78.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%豬油、0.2%膽鹽、10%蛋黃粉）、基礎飼料：福州吳氏動物實驗中心提供；TC、TG、LDL-C、HDL-C、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、白蛋白（albumin，ALB）檢測試劑盒：南京建成生物試劑有限公司；4%多聚甲醇、蘇木素、伊紅：北京索萊寶科技有限公司。

表1 功能紅曲中Monacolin K、桔霉素、黃曲霉毒素含量Table 1 Contents of Monacolin K,citrinin,aflatoxin in the functional Monascus

1.2 儀器與設備

TDL-40B離心機：上海安亭科學儀器廠；Mk3酶標儀：美國Thermo公司；M199切片機：德國萊卡公司；BMJ-A包埋機：常州中威電子儀器有限公司；BA210T顯微鏡：麥克迪奧實業(yè)集團有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高脂血癥大鼠模型建立

60只SD雄性大鼠，2月齡，購于杭州醫(yī)學院，合格證號：SCXK（浙）2019-0002。

適應性飼養(yǎng)1周后，將60只隨機分為正常組（n=10）與高脂飼料組（n=50），其中正常組給予基礎飼料喂養(yǎng)，高脂飼料組喂養(yǎng)高脂飼料來建立高脂血癥模型。2周后尾靜脈采血測定TC水平，高脂飼料組TC水平（3.47±0.71）mmol/L顯著高于正常組（1.64±0.22）mmol/L，說明模型成功。

1.3.2 動物分組及藥物干預

根據(jù)TC水平，將高脂血癥模型大鼠隨機分為5組：模型組（高脂飼料）、FRYR低劑量組（高脂飼料＋低劑量FRYR）、FRYR中劑量組（高脂飼料＋中劑量FRYR）、FRYR高劑量組（高脂飼料＋高劑量FRYR）、洛伐他汀組（高脂飼料+洛伐他?。?。根據(jù)大鼠體質量，F(xiàn)RYR低、中、高劑量組每日分別給予FRYR（折算成MK劑量）0.09 mg/kg、0.16 mg/kg、0.21 mg/kg灌胃，洛伐他汀組每日給予洛伐他汀0.21 mg/kg灌胃（根據(jù)大鼠與成人藥物等效劑量換算）[15-16]，正常組和模型組每日給予等量的生理鹽水灌胃。藥物連續(xù)干預6周，在末次給藥后禁食12 h后進行腹主動脈采血及肝臟收集。

1.3.3 藥物干預前后體質量增長率檢測

藥物干預6周后，根據(jù)以下公式計算小鼠的體質量增長率：

1.3.4 血生化指標檢測

大鼠血液收集于采血管中，室溫靜止2 h，3 000 r/min離心15 min，收集上層血漿并根據(jù)試劑盒說明書方法測定血漿中TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、AKP、ALB含量。

1.3.5 肝臟形態(tài)學觀察

將肝臟從大鼠中迅速分離，置于4%多聚甲醛固定48 h，切成大小適中塊狀后進行脫水、包埋、切片、脫蠟、蘇木素-伊紅染色、封片[17]，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結果以“平均值±標準差”表示，并采用SPSS20.0軟件進行分析，ALT、AST采用單因素方差分析（最小顯著差異（least significant difference，LSD）法進行組間兩兩比較），其余指標采用非參數(shù)秩和檢驗（Kruskal-Wallis法進行組間兩兩比較）。P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 大鼠體質量變化

藥物干預6周后，與灌胃前相比，各組大鼠的體質量增長率測定結果見表2。由表2可知，模型組的大鼠體質量增長率明顯高于正常組（P＜0.05）；相比模型組，F(xiàn)RYR各劑量組、洛伐他汀組的體質量增長率低于模型組，但無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠體質量增長率（n=10）Table 2 Body mass growth rate of rats in each group (n=10)

2.2 大鼠血脂水平變化

TC、TG在維持脂質代謝穩(wěn)定方面上扮演著重要角色，其與心血管疾病發(fā)生呈正相關[18-20]。LDL-C過高易引起動脈粥樣硬化，而HDL-C的作用剛好相反，有抗動脈粥樣硬化的效果[21-24]。

藥物干預6周后，測定各組大鼠的血脂水平，結果見表3。由表3可知，與正常組相比，模型組的大鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著提高（P＜0.05），HDL-C水平顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)RYR高劑量組血清TC、TG、LDL-C水平均顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著提高（P＜0.05）；中、低劑量FRYR能顯著降低高脂血脂大鼠血清TC、LDL-C水平（P＜0.05），但對TG、HDL-C作用不明顯（P＞0.05）；高劑量FRYR不僅能明顯降低高脂血癥大鼠血清TG、TC、LDL-C水平，同時也能明顯提高HDL-C水平；洛伐他汀組對高脂血癥大鼠血清TC、HDL-C、LDL-C的影響類似高劑量FRYR組，但對TG水平作用不明顯。

表3 各組大鼠血脂水平（n=10）Table 3 Serum lipid levels of rats in each group (n=10)

以上結果提示，對于高膽固醇型、高甘油三酯型、混合型等不同類型高脂血癥治療時，F(xiàn)RYR最適宜的給藥劑量不太一致，最好能根據(jù)患者實際情況實現(xiàn)個體化給藥。相同劑量下，F(xiàn)RYR在降低高脂血癥大鼠TG效果上優(yōu)于洛伐他汀，這可能與其含不需要經(jīng)肝臟代謝就能直接起效的酸式MK有關。

2.3 大鼠AST、ALT、AKP、ALB水平變化

肝臟是機體參與脂質代謝最主要的器官，長期的高脂飲食容易導致肝損傷[25]。AST、ALT、AKP常常作為肝功能重要評價指標，其水平與肝損傷程度呈正相關[26]。藥物干預6周后，各組大鼠血清的AST、ALT、AKP、ALB測定結果見表4。

表4 各組大鼠血清的谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、堿性磷酸酶、血清白蛋白水平（n=10）Table 4 The serum aspartate aminotransferase,alanine aminotransferase,alkaline phosphatase and albumin level of rats in each group (n=10)

由表4可知，與正常組相比，模型組的大鼠血清中ALT、AKP水平顯著提高（P＜0.05），而AST僅有上升的趨勢（P＞0.05）；高劑量FRYR能顯著降低高脂血癥大鼠AST、ALT、AKP水平，而低劑量FRYR對高脂血癥大鼠AST、ALT、AKP水平影響不大。同時高劑量FRYR對高脂血癥大鼠AST調節(jié)能力優(yōu)于洛伐他汀組，這可能與紅曲含多種活性成分相關。ALB是血漿中含量最多的蛋白，由肝實質細胞合成而來，臨床上常作為肝疾病、腎疾病、組織損傷等評價指標。本實驗結果表明，各組間大鼠血清ALB水平無顯著性差異（P＞0.05）。這說明FRYR有減輕高脂血癥大鼠脂肪肝病變的作用，且呈一定劑量依賴性。

2.4 肝臟形態(tài)變化

2.4.1 外觀觀察結果

各組大鼠肝臟的外觀觀察結果見圖1。由圖1可知，正常組大鼠肝臟表面光滑，質地均勻，顏色為鮮紅色，邊緣薄而銳利；模型組大鼠肝臟體積、質量均明顯增加，表面無光澤呈乳白色，質地易碎，邊緣鈍而厚；FRYR各劑量組、洛伐他汀干預后肝臟形態(tài)、外觀色澤、體積及質量均有改善。

圖1 各組大鼠肝臟外觀Fig.1 Liver appearance of rats in each group

2.4.2 顯微鏡觀察結果

各組大鼠肝臟蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色結果見圖2。

圖2 各組大鼠肝臟蘇木精-伊紅（HE）染色結果Fig.2 Liver hematoxylin-eosin(HE)staining results of rats in each group

由圖2可知，與正常組相比，模型組大鼠肝臟出現(xiàn)大量的脂肪空泡，肝細胞呈氣球樣變且排列不規(guī)則；FRYR干預后能減輕高脂血癥大鼠肝臟脂肪變性，且療效呈劑量相關性，濃度越高療效越明顯；洛伐他汀治療后，高脂血癥大鼠肝臟脂肪空泡明顯減少，細胞形態(tài)及排列均相對規(guī)則，肝臟脂肪變性程度下降。

3 討論

同等劑量下的FRYR的對高脂血癥大鼠AST、TG調節(jié)能力優(yōu)于化藥洛伐他汀，而其余指標兩者類似。另外，MK含量極有潛力作為FRYR質量評價及降脂給藥劑量依據(jù)的指標。但由于此次對FRYR的研究只是小樣本實驗，且干預時間較短，對于今后FRYR能否能替代他汀類的治療，需要后期進行大規(guī)模的臨床療效觀察、循證醫(yī)學研究。

4 結論

本研究成功建立了高脂血癥大鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)針對高膽固醇型、高甘油三酯型、混合型等不同類型高脂血癥治療時，F(xiàn)RYR最適宜的給藥劑量不太一致。另外，高劑量FRYR對高脂血癥大鼠的血脂、肝功能調節(jié)總體優(yōu)于化藥洛伐他汀。另外，以MK含量作為FRYR給藥劑量的依據(jù)具有一定的可行性，但仍需后期進一步驗證。