陳碩昌，仝秋平，郭曉磊，朱 萍，蒙健宗，楊 輝，3

（1.廣西大學 生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004；2.亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004；3.廣西微生物與酶工程技術研究中心，廣西 南寧 530004）

左聚糖是一種果聚糖，主鏈主要由呋喃果糖殘基以β-（2,6）糖苷鍵連接形成，支鏈由少量β-（2,1）糖苷鍵連接形成。左聚糖通常由微生物生產，分子質量多為105～107Da，植物生產的左聚糖含量低且分子質量一般較小[1]。在食品工業(yè)中，由于左聚糖有良好的水溶性、高分子質量和低黏度等特性，所以可用作乳化劑、穩(wěn)定劑和增稠劑[2]。在制藥工業(yè)中，左聚糖可用作血漿擴容劑、減肥劑和降膽固醇劑等[3]。此外，由于左聚糖具有保濕性質、低細胞毒性、促進哺乳動物細胞增殖和抗炎作用，還可用于化妝品中[4]。目前左聚糖的制備主要分為直接提取、化學合成、微生物發(fā)酵和酶法合成四種，其中酶法合成左聚糖操作簡單，純化方便，對工業(yè)生產中有著廣闊的發(fā)展前景[5-6]。左聚糖蔗糖酶屬于GH68糖苷水解酶家族，同時具有水解蔗糖和轉果糖基的雙重活性。

與大腸桿菌（Escherichia coli）相比，畢赤酵母（Pichia pastoris）的安全性更好，已被認定為一般公認為安全（generally recongnized as safe，GRAS）微生物[7]。畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)是當前最有效、最方便、最廣泛的外源蛋白表達系統(tǒng)之一[8-9]，其具有安全性好[10]、外源基因可穩(wěn)定存在[11]、可實現(xiàn)分泌表達和適合工業(yè)化生產[12]等優(yōu)點，畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)已在食品、醫(yī)藥和工業(yè)酶制劑[13]等領域廣泛應用。外源基因可以通過同源重組整合到畢赤酵母（Pichia pastoris）的基因組上，并且可以在同一位點多次同源重組從而插入多個拷貝。有研究表明，多拷貝菌株通常比單拷貝菌株表達更多的外源蛋白[14]，但是重組菌株外源蛋白表達量并不都是隨著拷貝數(shù)增加而增加[15-16]。目前關于利用酵母表達重組左聚糖蔗糖酶的報道較少，并且缺乏拷貝數(shù)對重組畢赤酵母（Pichia pastoris）左聚糖蔗糖酶分泌表達水平影響的相關研究。

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）是一種核酸定量技術[17]，可用于研究基因組學，與Southern印跡和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）測序來鑒定擴增子相比，RT-qPCR具有操作簡單、特異性強、靈敏和高通量等優(yōu)點[18]，已成為檢測信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的首選方法[19]。

本研究采用雙標準曲線法RT-qPCR技術，以畢赤酵母（Pichia pastoris）的持家基因gap為內參，通過SYBR Green模式的RT-qPCR測定重組畢赤酵母中左聚糖蔗糖酶基因SacB[6]的基因拷貝數(shù)及轉錄水平，意在探究不同基因拷貝數(shù)及相應mRNA轉錄水平的變化對重組畢赤酵母分泌表達左聚糖蔗糖酶的影響，為篩選高效表達的重組菌株提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

大腸桿菌（Escherichia coli）trans10：北京全式金生物技術有限公司；畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115：美國Invitrogen公司；含不同SacB基因拷貝數(shù)的畢赤酵母菌株：由本實驗室前期將含SacB基因的質粒pPIC9K通過氯化鋰轉化法轉化畢赤酵母GS115所得；pMD19-T Vector：寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。

1.1.2 主要試劑

酵母基因組DNA（genome DNA，gDNA）提取試劑盒、無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）、生物素（vitamin H，VH）（純度＞99%）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalactopyranoside，X-gal）（純度＞99%）：北京索萊寶科技有限公司；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式膠回收試劑盒：上海生工生物技術有限公司；酵母RNA提取試劑盒：美國OMEGA公司；逆轉錄試劑盒：北京全式金生物技術有限公司；Ultra SYBR Mixture：康為世紀生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）（純度＞98.0%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母浸出粉、胰蛋白胨（均為生化試劑）：英國Oxoid公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸出粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：胰蛋白胨20.0 g/L，酵母浸出粉10.0 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；葡萄糖20.0 g/L，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

含有甘油的緩沖性完全（buffered minimal glycerol YP medium，BMGY）培養(yǎng)基：胰蛋白胨20.0 g/L，酵母浸出粉10.0 g/L，0.1 mol/L磷酸鹽鉀緩沖液（0.1 mol/L K2HPO4與0.1 mol/L KH2PO4混合調節(jié)pH=6.0）100 mL/L，10%（V/V）甘油100 mL/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；13.4%YNB 100 mL/L，0.2 mg/mL生物素2 mL/L，0.22 μm孔徑無菌濾膜過濾除菌。

含有甲醇的緩沖性完全（buffered minimal methanol YP medium，BMMY）培養(yǎng)基：胰蛋白胨20.0 g/L，酵母浸出粉10.0 g/L，0.1 mol/L磷酸鹽鉀緩沖液（0.1 mol/L K2HPO4與0.1 mol/L KH2PO4混合調節(jié)pH=6.0）100 mL/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；13.4%YNB 100 mL/L，0.2 mg/mL生物素2 mL/L，5%（V/V）甲醇100 mL/L，0.22 μm孔徑無菌濾膜過濾除菌。

藍白斑篩選（blue-white screening，BWS）培養(yǎng)基[20]：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸出粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，瓊脂粉15g/L，121 ℃，高壓蒸汽滅菌20 min；氨芐青霉素100 mg/mL，X-gal 24 μg/mL，IPTG 24 μg/mL。

1.2 儀器與設備

NanoDropTMOne微量核酸定量儀：賽默飛世爾科技（中國）公司；LightCycler480 II實時熒光定量PCR儀：瑞士ROCHE公司；PTC-2000 PCR儀：美國MJ Research公司；SKY-211B恒溫搖床：上海蘇坤實業(yè)有限公司；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；PHS-25 pH計：上海金邁儀器儀表有限公司；LDZX-50FBS滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；UV-1601紫外分光光度計：上海市第三分析儀器廠；Avanti J-E、Microfuge 20低溫離心機：美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計

根據(jù)美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫公布的畢赤酵母gap基因序列（U62648）設計GAP引物gap-1和gap-2，根據(jù)重組畢赤酵母菌株的SacB基因序列設計SacB引物SacB-1和SacB-2見表1。

表1 本實驗中使用的引物序列Table 1 The primer sequences used in the experiments

1.3.2 構建標準質粒

接種GS115、重組畢赤酵母，分別提取GS115和重組畢赤酵母的gDNA。以GS115的gDNA為模板，PCR擴增gap基因片段；以重組畢赤酵母的gDNA為模板，PCR擴增SacB基因片段?；厥誫ap和SacB片段后分別連接到pMD19-TVector，轉化大腸桿菌后涂布于藍白斑篩選平板過夜培養(yǎng)。挑取白色單菌落進行菌落PCR鑒定，將陽性克隆送往北京六合華大基因科技有限公司測序，測序正確的質粒作為RT-qPCR的標準質粒，分別命名為T-gap和T-SacB。

1.3.3 待測樣品的制備

接種重組畢赤酵母于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)至OD600nm值=1.0，用酵母基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA。

接種重組畢赤酵母于YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至OD600nm值=2.0～6.0，后，以1%（V/V）接種量接種至BMGY液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)至OD600nm值=15～20，離心收集菌體后轉移至BMMY液體培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min誘導產酶，每24 h添加1%（V/V）甲醇。分別在誘導時間為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h取樣，提取總RNA反轉錄制備合成互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）樣品。cDNA反應體系共20 μL，其中含Anchored Oligo（dT）18Primer（0.5 μg/μL）1 μL，模板RNA 50 ng～5 μg，2×TS Reaction Mix 10 μL，TranscripRT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover1μL，補足無酶無菌水（RNase-Free Water）至20 μL。將RNA模板、引物與RNase-free water混勻，65 ℃孵育5 min后冰浴2 min，再加入其他組分；42 ℃孵育15 min；85 ℃，5 s失活處理。

1.3.4 RT-qPCR擴增體系及程序

PCR擴增體系（20 μL）：含引物各0.5 μL（10 μmol/L），模板0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）8.5 μL，2×Ultra SYBR Mixture 10 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)。熔解曲線分析程序：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s。

1.3.5gap和SacB基因標準曲線的建立

用SanPrep柱式質粒DNA小量提取試劑盒分別從構建好含有標準質粒的菌株抽提T-gap和T-SacB，用微量核酸測定儀測定濃度，根據(jù)以下公式計算標準質粒的拷貝數(shù)：（6.02×1023）×（g/mL）/（DNA堿基長度×660）=拷貝數(shù)/mL。分別以1 μL不同稀釋度質粒溶液（103、104、105、106、107個拷貝數(shù)/μL）作為模板，以RTgap-1/RTgap-2和RTSacB-1/RTSacB-2引物進行RT-qPCR，每個濃度檢測3次。以Ct值（y）作為縱坐標，起始模板中質?？截悢?shù)的對數(shù)值（x）作為橫坐標，建立GAP和SacB基因的標準曲線[21]。通過運用雙標準曲線法可以分析目的基因的相對含量[22]。

1.3.6SacB基因拷貝數(shù)和轉錄水平的檢測

檢測SacB基因拷貝數(shù)和轉錄水平時，分別以重組畢赤酵母的gDNA樣品及其不同發(fā)酵階段的cDNA樣品為模板，分別用引物RTgap-1/RTgap-2和RTSacB-1/RTSacB-2進行RT-qPCR檢測，每個樣品檢測3次。gap基因在畢赤酵母的基因組中以單拷貝的形式存在[23]，因此SacB基因在畢赤酵母基因組中的起始拷貝數(shù)為SacB與gap基因拷貝數(shù)的比值。檢測重組畢赤酵母轉錄水平時，采用樣品mRNA含量對內參進行相對定量檢測分析mRNA表達變化。

1.3.7 左聚糖蔗糖酶酶液的制備及酶活測定

胞外酶液的制備：發(fā)酵液低溫離心后的上清即為胞外粗酶液。

胞內酶的制備：①4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，10 mL ddH2O清洗菌體1次，20 mL磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）清洗菌體2次；②用磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）重懸細胞至OD600nm值=50～100；③加入等體積的酸洗玻璃珠（0.5 mm），渦旋30 s，冰上孵育30 s，重復7次；④4 ℃、12 000 r/min離心10 min離心得上清即為胞內粗酶液。

采用DNS法測定左聚糖蔗糖酶水解活力[5]。一分子蔗糖可水解成一分子果糖和一分子葡萄糖，實驗所需測的是葡萄糖生成量，因此所測還原糖含量需乘1/2即為葡萄糖的真實生成量。左聚糖蔗糖酶酶活定義為：在最適pH、溫度條件下，1 min催化蔗糖轉化成1 μmol葡萄糖所需左聚糖蔗糖酶的量為1個酶活單位（U/mL）[6]。

2 結果與分析

2.1 建立gap和SacB基因的標準曲線

gap和SacB基因擴增及熔解曲線見圖1。由圖1可知，gap和SacB基因的擴增曲線光滑平穩(wěn)，有明顯的指數(shù)增長期，擴增效率較高，符合定量檢測要求；熔解曲線均只有一個單一峰，表明PCR產物中無非特異性產物，證明RTqPCR的兩對引物具有較好的特異性。gap和SacB基因的標準曲線見圖2。由圖2可知，gap基因標準曲線回歸方程為y=-3.432x+37.099（R2=0.999），SacB基因標準曲線回歸方程為y=-3.408 7x+36.635 0（R2=0.999）。根據(jù)兩條標準曲線斜率求出gap和SacB基因擴增效率分別為95.6%和96.5%。

圖1 標準質粒的擴增曲線（a,b）及熔解曲線（c,d）Fig.1 Amplification curves (a,b) and melting curves (c,d) of standard plasmids

圖2 gap（a）和SacB（b）基因的標準曲線Fig.2 Standard curves of gap (a) and SacB (b) gene

2.2 重組畢赤酵母中SacB基因拷貝數(shù)檢測

6個菌株基因拷貝數(shù)檢測結果見表2。由表2可知，只有1號菌株在基因組中存在多個拷貝，其余5個重組菌株中SacB基因拷貝數(shù)均＜2，且RT-qPCR得到的Ct值的標準偏差均在0.27以下，檢測結果重復性良好。待測基因組DNA樣品的擴增曲線及熔解曲線見圖3。由圖3可知，擴增曲線呈光滑S型，熔解曲線呈單峰型，樣品均不存在非特異性擴增。

圖3 待測基因組DNA樣品的擴增曲線（a,b）及熔解曲線（c,d）Fig.3 Amplification curves (a,b) and melting curves (c,d) of genomic DNA samples to be tested

表2 實時熒光定量PCR檢測gap和SacB基因的拷貝數(shù)Table 2 Copy numbers of gap and SacB gene detected by real-time fluorescence quantitative PCR

2.3 重組畢赤酵母基因拷貝數(shù)與總酶活的關系

不同拷貝數(shù)的重組畢赤酵母菌株于BMMY培養(yǎng)基中誘導產酶，誘導96 h后測定總酶活，結果見圖4。由圖4可知，在重組畢赤酵母菌株中，基因拷貝數(shù)低的菌株具有較低酶活，基因拷貝數(shù)高的菌株則具有較高酶活。整體趨勢上隨著拷貝數(shù)的增加，酶活亦增加，二者呈正相關關系。然而并不都是基因拷貝數(shù)越高菌株的蛋白表達量越多，在某些情況下，較高的基因拷貝菌株會導致重組蛋白表達量減少。如ZHU T等[16]通過研究不同豬胰島素前體（porcine insulin precursor，PIP）拷貝數(shù)的重組畢赤酵母時發(fā)現(xiàn)12個左右拷貝的重組菌分泌表達的蛋白最好，當PIP基因拷貝數(shù)多于12時，重組蛋白的表達量受到顯著影響。高拷貝菌株表達量降低可能的原因是由于分泌表達通路受到阻礙，外源基因mRNA量過多加大了內質網(wǎng)中蛋白折疊和胞內囊泡運輸?shù)膲毫?。因此，通過比較不同拷貝數(shù)重組菌株的外源蛋白表達量才能篩選出最佳拷貝數(shù)的菌株[24]，從而獲得更多的重組蛋白。

圖4 基因拷貝數(shù)對重組畢赤酵母總酶活的影響Fig.4 Effects of gene copy numbers on total enzyme activities of recombinant Pichia pastoris

2.4 重組畢赤酵母轉錄水平分析

本研究應用兩步法RT-qPCR來定量基因表達，兩步法RT-qPCR的數(shù)據(jù)是可重現(xiàn)的，且其在靈敏度、靈活性和條件優(yōu)化等方面較一步法好[25]。在使用DNA結合染料時，采用兩步法操作方案可以通過控制解鏈溫度更輕松地消除引物二聚體[26]。

檢測重組畢赤酵母轉錄水平時選取5號菌株為單拷貝菌株，1號菌株為多拷貝菌株。通過RT-qPCR檢測不同誘導時間單拷貝與多拷貝菌株的cDNA樣品，結果見圖5、圖6。由圖5（a）-（b）、圖6（a）-（b）可知，樣品的擴增曲線均呈光滑S型。由圖5（c）-（d）、圖6（c）-（d）可知，樣品的熔解曲線中均為單峰可知擴增產物是特異性的。通過雙標準曲線法計算樣品的轉錄水平，結果見表3、表4。由表3、表4可知，單拷貝菌株的最高轉錄水平是0.42，遠低于高拷貝菌株的2.13，單拷貝和多拷貝菌株的總酶活隨誘導時間增加均呈上升趨勢。通過折線圖呈現(xiàn)表3、表4中的數(shù)據(jù)，結果見圖7。結合t檢驗分析由圖7（a）可知，多拷貝菌株的轉錄水平比單拷貝菌株顯著提高（P＜0.05）。在添加甲醇24 h后單拷貝菌株及多拷貝菌株的轉錄水平均為最大值，其后二者轉錄水平隨誘導時間下降。由圖7（b）可知，單拷貝菌株與多拷貝菌株的酶活在添加甲醇24 h后均隨誘導時間不斷上升，結合t檢驗分析知多拷貝菌株的酶活較單拷貝菌株顯著提高（P＜0.05）。究其緣由，在誘導過程中，碳源為補加的甲醇來提供，因此誘導過程中碳源的波動和頻繁出現(xiàn)的匱乏會影響轉錄，降低外源蛋白的合成速率[27]。RNA轉錄水平隨著誘導時間遞減，由于分泌蛋白的累積效應，酶活會不斷增加。

表3 甲醇補料發(fā)酵中單拷貝菌株轉錄水平與酶活的關系Table 3 Relationship between transcription level and enzyme activity of single-copy strain in methanol supplementary fermentation

表4 甲醇補料發(fā)酵中多拷貝菌株轉錄水平與酶活的關系Table 4 Relationship between transcription level and enzyme activity of multi-copy strain in methanol supplementary fermentation

圖5 重組畢赤酵母單拷貝菌株擴增曲線（a,b）及熔解曲線（c,d）Fig.5 Amplification curves (a,b) and melting curves (c,d) of recombinant Pichia pastoris single-copy strains

圖6 重組畢赤酵母多拷貝菌株擴增曲線（a,b）及熔解曲線（c,d）Fig.6 Amplification curves(a,b) and melting curves(c,d) of recombinant Pichia pastoris multi-copy strains

圖7 不同拷貝數(shù)菌株的轉錄水平（a）與表達酶活（b）Fig.7 Transcriptional level (a) and expression enzyme activity (b) of strains with different copies

增加mRNA轉錄水平最常見的策略是引入多個外源基因的拷貝，多拷貝菌株通常表現(xiàn)為高表達重組蛋白[14，28]。錢曉芬等[15]用畢赤酵母表達牛乳鐵蛋白功能片段時發(fā)現(xiàn)重組蛋白產量隨著BlfFf基因拷貝數(shù)的增加而增加，但并非線性遞增，拷貝數(shù)為3的菌株產量相比單拷貝的菌株提高了150%。此外，畢赤酵母分泌表達異源蛋白與其攜帶的信號肽有關，KANG H K等[29]構建的攜帶α信號肽的腸膜明串珠菌中左聚糖蔗糖酶基因的重組畢赤酵母成功的進入了畢赤酵母的分泌途徑，而攜帶腸膜明串珠菌左聚糖蔗糖酶自身信號肽的重組菌株卻未能成功分泌，其研究中左聚糖蔗糖酶最高產酶量為8.72 U/mL。此外有假設指出[30]，不同基因可能會消除一些物種的特異性，使蛋白更傾向于跨物種間的表達。本研究構建的重組畢赤酵母分泌表達效果較好，達13.96 U/mL，后續(xù)可以通過密碼子優(yōu)化、糖基化修飾、引入分子伴侶等技術進一步優(yōu)化菌種來提高表達量。

3 結論

通過檢測重組畢赤酵母不同SacB基因拷貝數(shù)及相應mRNA轉錄水平的變化，成功篩選出高效分泌表達左聚糖蔗糖酶的重組菌株。重組畢赤酵母整合的左聚糖蔗糖酶基因在1～3個拷貝范圍內，隨著拷貝數(shù)增加，重組菌的酶活也隨之增加，其中多拷貝菌株的mRNA轉錄水平（2.13）為單拷貝菌株（0.42）的5.1倍，多拷貝菌株的酶活（13.96 U/mL）比單拷貝菌株（5.48 U/mL）提高1.5倍。本研究說明畢赤酵母是表達SacB的良好宿主，繼續(xù)提高拷貝數(shù)有進一步提高表達水平的潛力，同時表明可通過篩選出最佳基因拷貝數(shù)的重組畢赤酵母及重組菌的進一步優(yōu)化來提高外源蛋白的表達量，為構建其他外源基因的高表達重組畢赤酵母菌株提供參考。