羅愛國，楊牛恬，鄭同慶，孟亞浩，王苑苑，趙 佳，郝建偉，胡變芳

（1.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 晉中 030619；2.晉中學(xué)院固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，山西 晉中 030619；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；4.山西省堡子酒業(yè)有限公司，山西 晉中 030699）

“醅作肉，水作血，曲為骨”[1]，曲的種類決定了酒的香型和風(fēng)格[2]。清香型白酒的特有風(fēng)格是由曲中特有的微生物菌系和風(fēng)味前體物形成的，大曲富含微生物酶系、菌系和曲香物質(zhì)[3]，菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是白酒生產(chǎn)過程中的主要糖化發(fā)酵劑，對白酒品質(zhì)的提升和風(fēng)味的形成尤為重要。因此，對清香型白酒釀造大曲菌群結(jié)構(gòu)的多樣性進行解析，了解大曲中微生物的菌群結(jié)構(gòu)不僅可以科學(xué)認(rèn)識白酒釀造過程與機制的必要途徑，也對白酒釀造技術(shù)的發(fā)展具有重要作用。

在釀造大曲微生物的結(jié)構(gòu)多樣性的研究中，傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)運用較為廣泛，是研究白酒微生物最早的方法，但該方法耗時耗力，且僅能分離出1%～5%的微生物[4]。目前，該技術(shù)主要應(yīng)用于單一樣品中的某一類微生物的篩選。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的興起，可以更客觀的探索樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性[5]。葉光斌等[6]運用限制性片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術(shù)分析了3種清香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異發(fā)現(xiàn)，3種大曲細(xì)菌均屬于芽孢桿菌綱、放線菌綱及變形菌綱，而具體種屬組成存在差異。周森等[7]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）確定了牛欄山清香型大曲釀酒酵母的發(fā)酵產(chǎn)物，雖然其風(fēng)味種類差異較小，但乙酸、3-甲基丁醇等風(fēng)味物質(zhì)的生成量存在較大差異。甄攀[8]采用高通量測序技術(shù)，對汾酒生產(chǎn)用曲樣品的擴增高變區(qū)進行測序，在97%的相似度水平下，一共獲得502個細(xì)菌操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）、90個真菌OTU，并于科分類水平下得出優(yōu)勢細(xì)菌科及優(yōu)勢真菌科。目前，使用最廣泛的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)是高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)，其具有測序數(shù)據(jù)量大、時間短、成本低、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點[9]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醬香和濃香型白酒釀造微生物的研究中[10]，而應(yīng)用于清香型白酒釀造微生物的研究報道較少。

本研究以山西清香型堡子酒釀酒大曲為研究對象，采用高通量測序技術(shù)，對大曲樣品的16S rRNA V3-V4區(qū)和ITS1-ITS2區(qū)基因序列進行測序，研究清香型白酒釀酒大曲的微生物菌群結(jié)構(gòu)，并對其進行功能預(yù)測。以期為堡子酒釀造過程中功能微生物的篩選提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香型堡子酒釀酒大曲：山西堡子酒業(yè)有限公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit：美國OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒：美國Life公司Robust PCR Master Mix、Hieff NGSTMDNA Selection Beads：上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21臺式離心機：賽默飛世爾科技有限公司；TND03-H-H混運型干式恒溫器：深圳拓能達科技有限公司；FR-1000凝膠成像系統(tǒng)：上海復(fù)日科技有限公司熒光計：美國英杰生命技術(shù)有限公司；ETC811聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品基因組DNA提取及PCR擴增

DNA提取：取自酒廠曲房內(nèi)的成熟大曲，將大曲的上部、中部、下部大曲樣品粉碎混勻，采用液氮研磨將樣品磨成粉末狀以便于提取，置于-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取酒曲樣品微生物總基因組DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒定量檢測DNA樣本濃度。

PCR擴增：以基因組DNA為模板進行PCR擴增，細(xì)菌16S V3-V4區(qū)采用的引物為341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）；真菌ITS1-ITS2區(qū)采用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTA GAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。第一輪PCR擴增體系Robust PCR Master Mix 15 μL，正反向引物各1 μL，PCR擴增產(chǎn)物10 ng，加雙蒸水（ddH2O）補至30 μL。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，5個循環(huán)；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。第二輪PCR擴增：以第一輪PCR擴增產(chǎn)物為模板進行擴增，擴增體系同“第一輪擴增”。

1.3.2 高通量測序

利用引物對細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)和真菌ITS1-ITS2區(qū)進行PCR擴增后，委托上海生工生物工程股份有限公司對擴增子片段進行高通量測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

使用Cutadapt（V1.18）軟件去除引物接頭序列，再根據(jù)雙端測序（paired-end，PE）reads之間的重疊關(guān)系，將成對的讀長拼接成一條序列，然后按照編碼標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到樣本數(shù)據(jù)，最后對樣本數(shù)據(jù)（Raw data）的質(zhì)量進行質(zhì)控（quality control，QC）過濾，去除含N序列和短序列，得到高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)（Clean data）。利用軟件USEARCH（V11.0.667）對有效數(shù)據(jù)（Clean data）按照97%的相似水平進行聚類。16S rRNA擴增片段通過核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）（http：//rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp）classifer軟件（V2.12）比對RDP數(shù)據(jù)庫，引物內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）使用Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比 對UNITE數(shù)據(jù)庫（http：//unite.ut.ee/index.php）進行物種注釋。分別在門、綱、目、科、屬水平上統(tǒng)計大曲樣品細(xì)菌和真菌的群落組成。

使用PICRUSt軟件（V1.1.4）比對16Sr RNA測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測樣本中的功能基因組成，從而分析樣本功能信息。在直系同源簇數(shù)據(jù)庫（clusters of orthologous groups，COG）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）進行預(yù)測，將未知蛋白質(zhì)序列與已知功能的原始蛋白質(zhì)序列進行比較，對基因產(chǎn)物進行同源分類。使用FUNGuild數(shù)據(jù)庫（http：//www.funguild.org/）解析大曲相關(guān)真菌的生態(tài)營養(yǎng)型（Trophic mode）和生態(tài)功能群（Guild）。置信等級選用極可能（Highly probable）和很可能（Probable）的OTU及其類別。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.1.1 原始數(shù)據(jù)處理

大曲樣品數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計結(jié)果見表1。由表1可知，大曲樣品數(shù)據(jù)經(jīng)測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制（QC）后得到的有效序列長度和平均序列長度降低，說明QC處理可以有效優(yōu)化樣品數(shù)據(jù)；最短序列長度增高和最長序列長度降低，說明異常長度的序列被去除，提高了處理結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.1.2 測序有效性分析

由圖1可知，大曲樣品細(xì)菌與真菌的稀釋性曲線逐漸趨向平坦，表明測序的數(shù)據(jù)合理，更多的序列數(shù)量只會產(chǎn)生較少OTU；且細(xì)菌豐度大于真菌。

圖1 大曲樣品中細(xì)菌與真菌的操作分類單元稀釋性曲線Fig.1 Operational taxonomic units rarefaction curve of bacteria and fungi in Daqu sample

2.1.3 OTU統(tǒng)計

16S rRNA測序獲得的OTU序列數(shù)為57 402條，ITS測序獲得的OTU序列數(shù)為70 631條；大曲樣品中的細(xì)菌OTU數(shù)為124，真菌OTU數(shù)為48，說明大曲樣品微生物組成中細(xì)菌種類較真菌種類豐富。

2.1.4 Rank-abundance曲線

豐度等級（Rank-abundance）曲線是分析多樣性的一種方式，用于同時解釋樣品多樣性的兩個方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度來反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高[11]。大曲樣品的Rank-abundance曲線見圖2。由圖2可知，大曲樣品中細(xì)菌OTU Rank曲線的曲線較寬，說明樣品中細(xì)菌豐富度較高；隨著OTU等級的增加，細(xì)菌曲線趨于平坦，真菌曲線越陡，說明在大曲樣本中細(xì)菌的均勻度逐漸提高，真菌的均勻度逐漸降低。

圖2 大曲樣品的Rank-abundance曲線Fig.2 Rank-abundance curve of Daqu sample

2.2 大曲樣品Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析可反映單個樣品內(nèi)的物種多樣性，Chao1和ACE指數(shù)可反映菌群的豐度；Shannon和Simpson指數(shù)反映菌群的多樣性[12]。大曲樣品α多樣性指數(shù)分析結(jié)果見表2。由表2可知，樣品序列覆蓋率均為0.99，表明樣品文庫具有較高的覆蓋率。與真菌相比，細(xì)菌的Shannon指數(shù)較高、Simpson指數(shù)較低，則表明細(xì)菌群落的多樣性高于真菌；細(xì)菌的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)較高，代表細(xì)菌物種豐富度較高。

表2 大曲樣品中微生物群落的α多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indexes of microbial community in Daqu sample

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

堡子酒釀酒大曲樣品中共檢測到8個細(xì)菌門、11個細(xì)菌綱、30個細(xì)菌目、49個細(xì)菌科、74個細(xì)菌屬；4個真菌門、7個真菌綱、9個真菌目、17個真菌科、28個真菌屬，表明大曲樣品中細(xì)菌群落的多樣性較高。

2.3.1 大曲樣品細(xì)菌門水平物種豐度分析

基于門水平大曲樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，大曲樣品中的細(xì)菌門主要為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和其他菌門（占比＜1%），其在大曲樣品中的相對豐度分別為42.90%、37.26%、13.61%、1.77%和0.28%。其中變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍藻菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）為優(yōu)勢菌門（相對豐度＞1%）。

圖3 基于門水平大曲樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of bacterial community structure in Daqu sample based on phylum level

基于屬水平大曲樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，大曲樣本中的優(yōu)勢細(xì)菌屬（相對豐度＞1%）主要為泛菌屬（Pantoea）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、雀麥屬（Bromus tectorum）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、拉烏爾菌屬（Raoultella）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、Triticum aestivum、腸桿菌屬（Enterobacter）、片球菌屬（Pediococcus）和乳酪短桿菌（Brevibacterium），其在大曲樣品中的相對豐度值分別為35.76%、17.53%、12.96%、5.32%、4.87%、4.79%、4.34%、2.97%、2.51%、2.08%、1.77%和1.26%，其他均為非優(yōu)勢菌屬（相對豐度＜1%）。

圖4 基于屬水平大曲樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.4 Analysis results of bacterial community structure in Daqu sample based on genus level

泛菌屬是大曲原料小麥內(nèi)生菌中的主要種群[13]。克羅彭斯特菌屬于高溫放線菌科[14]，其功能主要為轉(zhuǎn)化土壤中的有機物以及產(chǎn)生多種酶類物質(zhì)。葡萄球菌屬可代謝產(chǎn)生白酒中重要的風(fēng)味成分[15-16]，如3-甲基-1-丁醇和乙偶姻等。乳桿菌屬、魏斯氏菌屬及片球菌屬等乳酸菌能夠產(chǎn)生乳酸、乙酸等白酒風(fēng)味的前體物質(zhì)[1，17]，乳酸可減少酒體刺激、延長白酒后味，在清香型白酒入口綿柔中得到體現(xiàn)，但乳酸含量過多會會使口感酸澀，嚴(yán)重影響白酒風(fēng)味。乳酸菌含量的控制關(guān)鍵在于尋求合適配比，以實現(xiàn)酒體協(xié)調(diào)[18-19]。

2.3.2 大曲樣品細(xì)真菌門水平物種豐度分析

基于門水平大曲樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖5。由圖5可知，大曲樣品中的絕對優(yōu)勢真菌門（相對豐度＞90%）為子囊菌門（Ascomycota），相對豐度為99.08%，其他均為非優(yōu)勢真菌門（相對豐度＜1%）。對比張雙燕[20]關(guān)于清香型白酒大曲微生物組成的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大曲樣品中菌群種類組成與其所用大曲相似，但菌群所占比重存在差異。

圖5 基于門水平大曲樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.5 Analysis results of fungal community structure in Daqu sample based on phylum level

基于屬水平大曲樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖6。由圖6可知，大曲樣品的真菌屬主要為孢圓酵母屬（Torulaspora）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、畢赤氏酵母屬（Pichia）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）和其他菌屬，其在大曲樣品中的相對豐度分別為52.64%、33.54%、9.72%、1.54%和2.56%。其中孢圓酵母屬（Torulaspora）為第一優(yōu)勢真菌屬（相對豐度＞50%），伊薩酵母屬（Issatchenkia）為第二優(yōu)勢真菌屬（相對豐度＞30%），畢赤氏酵母屬（Pichia）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）為第三優(yōu)勢真菌屬（相對豐度＞1%），其他均為非優(yōu)勢菌屬（相對豐度＜1%）。

圖6 基于屬水平大曲樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.6 Analysis results of fungal community structure in Daqu sample based on genus level

從真菌屬水平菌群結(jié)構(gòu)上看，大多菌屬為酵母菌、根霉和曲霉等，其中酵母菌發(fā)酵能力較強，根霉和曲霉可代謝產(chǎn)生大量高活性的蛋白酶和糖化酶等，是大曲酶系的主要來源[21]，可為釀造過程提供發(fā)酵動力，因此篩選能力突出的菌種進行釀造，有望提高原料的利用和出酒率[22-23]。畢赤酵母屬和生絲畢赤酵母屬是白酒發(fā)酵中的重要功能微生物，可以代謝產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，如乙酸乙酯、4-羥基-2-丁酮等[24-25]。

2.4 基因功能預(yù)測與分析

2.4.1 COG功能預(yù)測

大曲樣品中細(xì)菌的COG功能預(yù)測結(jié)果見圖7。由圖7可知，預(yù)測大曲樣品細(xì)菌群落的COG功能為4類，分別為信息存儲與處理類（包括A、B、J、K和L）、代謝類（包括C、E、F、G、H、I、P和Q）、細(xì)胞信號和過程類（包括D、M、N、O、T、U、V、W、Y和Z）和特征差的功能（包括R和S）。排除特征差的功能，大曲樣品的蛋白功能主要集中在“氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝”（E），占比8.28%；“轉(zhuǎn)錄”（K）與“碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝”（G），分別占比7.48%和7.19%；其次“細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/胞外被膜生物合成”（M）、“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制”（T）、“復(fù)制，重組和修復(fù)”（L）與“翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成”（J）等功能，分別占比5.92%、5.82%、5.79%與5.68%。細(xì)菌基因功能主要集中在氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝、碳水化合物運輸和代謝的高表達，其原因可能是與清香型堡子酒釀酒大曲的制作工藝有關(guān)，堡子酒釀酒大曲以大麥、豌豆等為主要原料，在釀造過程中需微生物進行發(fā)酵分解[26-27]。

圖7 大曲樣品中細(xì)菌的COG功能預(yù)測結(jié)果Fig.7 COG function prediction results of bacteria in Daqu sample

2.4.2 FUNGuild功能預(yù)測

FUNGuild預(yù)測結(jié)果見表4。由表4可知，置信水平為極可能（Highly probable）的有10個OTU，很可能（Probable）的有31個OTU。這41個OTU屬于2個營養(yǎng)型，分別是病理營養(yǎng)型（12個OTU）和腐生營養(yǎng)型（14個OTU），此外還包括2種混合營養(yǎng)型，分別是病理營養(yǎng)型-腐生營養(yǎng)型（7個OTU）和病理營養(yǎng)型-腐生營養(yǎng)型-共生營養(yǎng)型（8個OTU）。其中共包括個4個單一生態(tài)功能群和9個混合生態(tài)功能群，單一生態(tài)功能群分別為動物病原菌（8個OTU）、排泄物腐生菌（1個OTU）、未定義腐生真菌（11個OTU）、植物病原菌（3個OTU）；混合生態(tài)功能群分別為動物病原菌-未定義腐生真菌（1個OTU）、動物病原菌-植物病原菌（1個OTU）、植物病原菌-未定義腐生真菌（2個OTU）、土壤腐生菌-未定義腐生真菌（2個OTU）、動物內(nèi)共生體-動物病原菌-植物病原菌-未定義腐生真菌（7個OTU）、動物病原菌-真菌寄生菌-未定義腐生真菌（1個OTU）、動物病原菌-植物病原菌-未定義腐生真菌（1個OTU）、動物內(nèi)共生體-動物病原菌-植物內(nèi)生菌-植物病原菌-未定義腐生真菌（2個OTU）、動物病原菌-植物內(nèi)生菌-未定義腐生真菌（1個OTU）。可見清香型白酒大曲真菌群落生態(tài)功能類群存在一定的復(fù)雜性，對此部分真菌仍待深入研究[28]。

表4 FUNGuild功能預(yù)測結(jié)果Table 4 Results of FUNGuild function prediction

續(xù)表

3 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)對清香型堡子酒釀酒大曲微生物菌群進行測序分析，闡明了樣品大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了清香型堡子酒釀酒大曲中核心功能微生物體系，并對微生物進行了基因功能預(yù)測。

從山西清香型堡子酒釀酒大曲中共分析到細(xì)菌OTU數(shù)為124，真菌OTU數(shù)為48，細(xì)菌微生物群落的豐富度、均勻度與多樣性均高于真菌。堡子酒釀酒大曲中的細(xì)菌主要隸屬于變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），優(yōu)勢細(xì)菌屬主要為泛菌屬（Pantoea）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、雀麥屬（Bromus tectorum）；堡子酒釀酒大曲中的真菌主要隸屬于子囊菌門（Ascomycota），第一優(yōu)勢真菌屬為孢圓酵母屬（Torulaspora）。此外，細(xì)菌蛋白功能集中在“氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝”、“轉(zhuǎn)錄”、“碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝”、“細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/胞外被膜生物合成”、“翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成”和“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制”；真菌共鑒定出2個營養(yǎng)型和2種混合營養(yǎng)型，以及4個單一生態(tài)功能群和9個混合生態(tài)功能群。