王淑梅，邸 維，于佳睿，王 雪，單 藝，易華西

（1.哈爾濱學(xué)院 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086；2.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，廣東 廣州 510430；3.中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100）

亞硝酸鹽作為護色劑或防腐劑在肉制品加工中被廣泛應(yīng)用。在一定條件下，亞硝酸鹽與二級胺或三級胺相互作用生成N-亞硝基化合物。存在于食品中的N-亞硝基化合物主要為N-亞硝胺類[1]，是毒性很強的一類物質(zhì)[2]。研究顯示，多種食物中都含有一定量的N-亞硝胺，如N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperi dine，NPIP）[1]，是食品中重要的致癌物[3]。N-亞硝胺誘發(fā)人體癌變具有明顯的器官親和性，不同化合物具有不同的致癌靶器官[4]。如外源性NDMA隨食物進入體內(nèi)，主要在腸道被吸收[4]，因此腸道黏膜成為NDMA發(fā)揮毒性作用的靶向組織[5]。而體內(nèi)亞硝化反應(yīng)生成內(nèi)源NDMA也發(fā)生在腸腔內(nèi)，因此，NDMA成為腸道癌的誘變劑[6]，誘導(dǎo)腸道黏膜細胞的損傷[7-9]。

在我國肉制品加工中，除控制護色劑、防腐劑使用量之外，也制訂了N-亞硝胺的限量標準?，F(xiàn)行食品安全國家標準GB 2762—2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》中規(guī)定肉制品中NDMA含量≤3 μg/kg，海產(chǎn)品中NDMA含量≤5 μg/kg。雖然對肉制品及海產(chǎn)品中NDMA含量有嚴格限定，但是隨著食品產(chǎn)地、種類及加工方式的不同，NDMA的含量也顯著不同。調(diào)查顯示，NDMA在我國熏肉制品中僅含0.3～6.5 μg/kg，而在日本加工干魷魚中含量高達300 μg/kg[4]。因此，除了改進加工工藝及在加工過程中添加抗氧化劑外，適當(dāng)增加亞硝化阻斷劑，如維生素C（vitamin C，VC）、維生素E（vitamin E，VE）、酚類及黃酮類的攝入量也可降低NDMA對人體的毒性損傷。

目前研究證實，乳酸菌可降低N-亞硝胺的毒性作用[2]，可直接降低食品（如泡菜、香腸）中N-亞硝胺的含量。LIAO E等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）120的添加可顯著降低中國傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品中的亞硝酸鹽和NDMA含量，說明乳酸菌是抑制中國傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品發(fā)酵過程中NDMA累積的一種有效方法。有研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬中的植物乳桿菌、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、噬酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）具有降低N-亞硝基化合物含量的能力[12]，有望與VC、VE和酚類等一同作為亞硝化阻斷劑。前期研究顯示，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）SB27作為發(fā)酵菌種具有較強的耐酸、耐膽鹽性能，可定植于人體腸道上皮細胞[13]。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究以干酪乳桿菌SB27為研究對象，考察NDMA、NDEA、NPYR和NPIP（0～80 μg/mL）對其生長繁殖的影響，并以VC（50 μmol/L）為陽性對照，采用細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit，CCK）-8法分析干酪乳桿菌SB27（103～106CFU/mL）降低NDMA、NDEA、NPYR和NPIP（0～80 μg/mL）對大鼠腸道黏膜細胞IEC-6毒性作用的能力，以期進一步明確干酪乳桿菌SB27降解N-亞硝胺及菌株發(fā)揮功能的關(guān)鍵成分提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞和菌株

大鼠腸道黏膜細胞IEC-6：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）SB27：分離自甘肅北部的牦牛乳，現(xiàn)保存于哈爾濱工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院。

1.1.2 化學(xué)試劑

N-二甲基亞硝胺、N-二乙基亞硝胺、N-亞硝基吡咯烷、N-亞硝基哌啶：美國Sigma-Aldrich公司；CCK-8試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胰酶消化液：美國Corning公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）：美國Thermo Fisher Scientific公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）：美國Corning公司。

MRS液體培養(yǎng)基[14]：蛋白胨10 g/L，牛肉膏8 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫-80 1.0 mL/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸氫二胺2 g/L，七水硫酸鎂0.58 g/L，三水乙酸鈉5 g/L，硫酸錳0.25 g/L，蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH 6.2～6.6，于121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。MRS固體培養(yǎng)基中添加瓊脂18 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

HEPA1100二氧化碳培養(yǎng)箱、Forma 102厭氧培養(yǎng)箱：美國Thermo Electron公司；CX31電子顯微鏡：日本Olympus公司；Sartorius AG PB-10 pH計：德國Sartorius公司；Bio-Rad-680酶標儀：美國Bio-rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1N-亞硝胺工作液的制備

將NDMA、NDEA、NPYR和NPIP溶于雙蒸水中，配成質(zhì)量濃度為10mg/mL的儲備液[15]，4℃保存。實驗中將10mg/mL儲備液稀釋成1 000 μg/mL工作液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2N-亞硝胺在MRS液體培養(yǎng)基中對菌株SB27生長的影響

取50 μL菌液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，輕微振蕩，37 ℃培養(yǎng)18 h，活化2代后備用。將N-亞硝胺工作液加入MRS液體培養(yǎng)基中，使終質(zhì)量濃度分別為0、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL[1]，將已活化的干酪乳桿菌SB27以4%（V/V）的接種量加入培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)7 d，每隔24 h采用傾注平板法進行菌落計數(shù)[16]。

1.3.3 干酪乳桿菌SB27對IEC-6細胞存活率的影響

將IEC-6細胞懸于DMEM中，調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL，將細胞懸液加入到96孔組織培養(yǎng)板中，每孔100 μL。待細胞完全貼壁后，移去細胞培養(yǎng)液，加入10 μL各劑量的干酪乳桿菌SB27，使其終濃度分別為0（空白對照組）、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL和106CFU/mL。各孔最后用DMEM補至100 μL。96孔培養(yǎng)板放置CO2培養(yǎng)箱中（5%CO2，95%空氣，100%相對濕度），37 ℃條件下分別培養(yǎng)至2 h、8 h、14 h和20 h時加入10 μL CCK-8溶液，再繼續(xù)孵育4 h。采用酶標儀檢測波長450 nm處的吸光度值，并計算細胞存活率，其計算公式如下：

式中：A0為具有DMEM和CCK-8溶液的孔的吸光度值；A1為具有DMEM、IEC-6細胞、CCK-8溶液和干酪乳桿菌SB27的孔的吸光度值；A2為具有DMEM、IEC-6細胞、CCK-8溶液的孔的吸光度值。

1.3.4 干酪乳桿菌SB27降低N-亞硝胺毒性作用的檢測

通過對大鼠腸道黏膜細胞IEC-6的生長增殖分析干酪乳桿菌SB27降低N-亞硝胺的毒性作用。采用CCK-8法，細胞處理及干酪乳桿菌SB27的添加同1.3.3，再分別加入NDMA、NDEA、NPYR和NPIP，使其終質(zhì)量濃度分別為0、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL，陽性對照組為VC（50μmol/L）。96孔培養(yǎng)板放置CO2培養(yǎng)箱中（5%CO2，95%空氣，100%相對濕度），37 ℃條件下培養(yǎng)至20 h時加入10 μL CCK-8溶液，再繼續(xù)孵育4 h。采用酶標儀檢測波長450 nm處的吸光度值，并計算細胞存活率，其計算公式如下：

式中：A0為具有DMEM和CCK-8溶液的孔的吸光度值；A3為具有DMEM、IEC-6細胞、CCK-8溶液、干酪乳桿菌SB27和N-亞硝胺的孔的吸光度值；A4為具有DMEM、IEC-6細胞、CCK-8溶液的孔的吸光度值。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

實驗重復(fù)3次，利用SAS 9.1軟件進行方差分析，結(jié)果表示為“平均值±標準偏差”（X±SD），顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 N-亞硝胺在MRS液體培養(yǎng)基中對干酪乳桿菌SB27生長的影響

N-亞硝胺在MRS液體培養(yǎng)基中對干酪乳桿菌SB27生長的影響見圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度的NDMA（a）、NDEA（b）、NPYR（c）和NPIP（d）對干酪乳桿菌SB27生長的影響Fig.1 Effect of different mass concentrations of NDMA (a),NDEA (b),NPYR (c) and NPIP (d) on Lactobacillus casei SB27 growth

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，各實驗組干酪乳桿菌SB27的活菌數(shù)均呈先升高后下降的趨勢，且各劑量組之間干酪乳桿菌SB27活菌數(shù)的差異不顯著（P＞0.05）。說明隨著培養(yǎng)時間的變化，干酪乳桿菌SB27活菌數(shù)的顯著差異是由菌株自身生長和繁殖周期所致，并非N-亞硝胺的毒性損傷。結(jié)果表明，N-亞硝胺在MRS液體培養(yǎng)基中對干酪乳桿菌SB27的生長增殖無顯著影響，與NOWAK A等[16]的研究結(jié)果相似。

2.2 干酪乳桿菌SB27對IEC-6細胞存活率的影響

干酪乳桿菌SB27對IEC-6細胞存活率的影響見圖2。

圖2 干酪乳桿菌SB27對IEC-6細胞增殖的影響Fig.2 Effect of Lactobacillus casei SB27 on IEC-6 cells proliferation

由圖2可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，各組IEC-6細胞的存活率呈現(xiàn)增長的趨勢，培養(yǎng)6h與培養(yǎng)24h差異顯著（P＜0.05）。但是在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，空白對照組和干酪乳桿菌SB27各劑量組差異不顯著（P＞0.05）。說明干酪乳桿菌SB27對大鼠腸道黏膜細胞IEC-6的存活率并未產(chǎn)生顯著的影響，因此可進行后續(xù)研究。

2.3 干酪乳桿菌SB27降低N-亞硝胺毒性的作用

VC每日推薦攝取量（recommended dietary allowance，RDA）約為60 mg/d[17]。人體每天攝入100 mg的VC會使血漿VC的濃度略低于60 μmol/L，由此推測平衡膳食條件下人血漿VC水平范圍為5～50 μmol/L[18]。研究也顯示，VC（50 μmol/L）在NPIP和NPYR存在下，對人的白血病細胞HL-60和肝癌細胞HepG2發(fā)揮保護作用。由于VC具有抗氧化性，又可減少N-亞硝胺對機體的損傷[19]，因此本研究選用VC（50 μmol/L）作為陽性對照，選定干酪乳桿菌SB27的活菌體成分，分析其發(fā)揮降低N-亞硝胺對IEC-6細胞毒性作用的能力。

2.3.1 干酪乳桿菌SB27降低NDMA毒性的作用

由圖3可知，當(dāng)干酪乳桿菌SB27添加量分別為104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL時，NDMA劑量為20～80 μg/mL時的IEC-6細胞存活率顯著高于空白對照組（P＜0.05），NDMA劑量為0～10 μg/mL時的細胞存活率與空白對照組差異不顯著（P＞0.05），以上各組與陽性對照組差異均不顯著（P＞0.05）。當(dāng)干酪乳桿菌SB27添加量為103CFU/mL時，NDMA劑量為80 μg/mL時的IEC-6細胞存活率顯著高于空白對照組（P＜0.05），NDMA劑量為0～40 μg/mL時的IEC-6細胞存活率與空白對照組差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 干酪乳桿菌SB27降低NDMA對IEC-6細胞毒性作用Fig.3 Effect of Lactobacillus casei SB27 on reducing the toxic of NDMA to IEC-6 cells

有研究表明，NDMA會導(dǎo)致肝臟、胃腸道黏膜的損傷或形成腫瘤，100 mg的NDMA會導(dǎo)致人體腹瀉、嘔吐、肝毒性或死亡[20]。乳酸菌作為功能性益生菌，可通過生物的方式對抗N-亞硝胺的遺傳毒性，抑制腸道黏膜的DNA損傷，如乳桿菌和雙歧桿菌可劑量依賴性地保護人體腸道細胞系（HT-29或Caco-2）的遺傳毒性作用[21]。本研究結(jié)果表明，干酪乳桿菌SB27（103～106CFU/mL）可降低NDMA對大鼠腸道黏膜細胞IEC-6的毒性作用，可抑制NDMA誘導(dǎo)IEC-6細胞的損傷，分析原因可能是干酪乳桿菌SB27降低了NDMA的含量。乳酸菌發(fā)揮降低NDMA毒性的作用可能是通過吸收或降解有毒化學(xué)物的含量[2]，減少有毒化學(xué)物合成前體物或是乳酸菌抗氧化功能發(fā)揮的作用[22-23]。

2.3.2 干酪乳桿菌SB27降低NDEA毒性的作用

由圖4可知，當(dāng)干酪乳桿菌SB27添加劑量為104、105和106CFU/mL時，NDEA劑量為40～80 μg/mL時的IEC-6細胞存活率顯著高于空白對照組（P＜0.05），而NDEA劑量為0～20 μg/mL時的IEC-6細胞存活率與空白對照組差異不顯著（P＞0.05），但以上各組均與陽性對照組差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)干酪乳桿菌SB27添加劑量為103CFU/mL時，NDEA劑量為80 μg/mL時的IEC-6細胞存活率顯著高于空白對照組（P＜0.05），NDEA劑量為0～40 μg/mL時的細胞存活率與空白對照組差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 干酪乳桿菌SB27降低NDEA對IEC-6細胞毒性的作用Fig.4 Effect of Lactobacillus casei SB27 on reducing the toxic of NDEA to IEC-6 cells

有研究表明，乳酸菌可降低泡菜中亞硝酸鹽的含量，且在MRS培養(yǎng)基中也有相似的研究結(jié)果[24]。戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）R3、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）R6、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）P1等五株乳酸菌在MRS培養(yǎng)液中可顯著降低NDEA的濃度[11]。NDEA屬于二級A類環(huán)境致癌物，會導(dǎo)致組織細胞活性氧的堆積，從而導(dǎo)致細胞的氧化應(yīng)激和毒性損傷[25]。由于L.pentosus可降低N-亞硝胺的含量[26]，其可作為潛在的提高肉制品質(zhì)量安全的一種發(fā)酵劑。本研究結(jié)果也說明，隨著NDEA添加劑量的增加，其對大鼠腸道黏膜細胞IEC-6的毒性損傷作用增強，而高劑量的干酪乳桿菌SB27（104～106CFU/mL）可顯著抑制NDEA對IEC-6細胞的毒性損傷。

2.3.3 干酪乳桿菌SB27降低NPYR毒性的作用

由圖5可知，當(dāng)干酪乳桿菌SB27添加量為104、105、106CFU/mL時，NPYR劑量為40～80 μg/mL時的IEC-6細胞存活率顯著高于空白對照組（P＜0.05），NPYR劑量為0～20 μg/mL時的IEC-6細胞存活率與空白對照組差異不顯著（P＞0.05），以上各組與陽性對照組差異均不顯著（P＞0.05）。當(dāng)干酪乳桿菌SB27添加劑量為103CFU/mL時，NPYR劑量為80 μg/mL時的IEC-6細胞存活率顯著高于空白對照組（P＜0.05），NPYR劑量為0～40 μg/mL時的IEC-6細胞存活率與空白對照組差異均不顯著（P＞0.05）。結(jié)果顯示，干酪乳桿菌SB27具有降低NPYR毒性的作用，減小了NPYR對IEC-6細胞存活的抑制作用。

圖5 干酪乳桿菌SB27降低NPYR對IEC-6細胞毒性的作用Fig.5 Effect of Lactobacillus casei SB27 on reducing the toxic of NPYR to IEC-6 cells

2.3.4 干酪乳桿菌SB27降低NPIP毒性的作用

由圖6可知，當(dāng)干酪乳桿菌SB27添加量為103、104、105CFU/mL時，NPIP劑量為80 μg/mL時的IEC-6細胞存活率顯著高于空白對照組（P＜0.05），NPIP劑量為0～40 μg/mL時的IEC-6細胞存活率與空白對照組差異不顯著（P＞0.05），以上各組與陽性對照組差異均不顯著（P＞0.05）。當(dāng)干酪乳桿菌SB27添加量為106CFU/mL時，NPIP各劑量組（0～80 μg/mL）的IEC-6細胞存活率與空白對照組差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 干酪乳桿菌SB27降低NPIP對IEC-6細胞毒性的作用Fig.6 Effect of Lactobacillus casei SB27 on reducing the toxic of NPIP to IEC-6 cells

由于NPIP是食品中普遍存在的致癌物[27]，而乳酸菌可降低食品中NPIP的含量，如彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）可顯著降低哈爾濱紅腸中NPIP的含量達14.6%[28]。本研究結(jié)果顯示，干酪乳桿菌SB27可在腸道內(nèi)發(fā)揮亞硝化阻斷的作用，抑制NPIP誘發(fā)腸道黏膜細胞的損傷。

3 結(jié)論

本研究分析了四類N-亞硝胺（NDMA、NDEA、NPYR和NPIP）對干酪乳桿菌SB27生長影響及干酪乳桿菌SB27降低N-亞硝胺對大鼠腸道黏膜細胞IEC-6毒性的作用。結(jié)果顯示，N-亞硝胺在MRS培養(yǎng)基中對干酪乳桿菌SB27的生長無顯著影響（P＞0.05），干酪乳桿菌SB27可降低N-亞硝胺對大鼠腸道黏膜細胞IEC-6的毒性作用。