許春青，李 陽(yáng)，魏莎莎，李田田，朱 丹，王 愈，張曉宇，許 女

（1.食醋發(fā)酵科學(xué)與工程山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030400；2.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030400；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801）

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是微生物根據(jù)周圍細(xì)胞密度產(chǎn)生和釋放信號(hào)分子[1]，信號(hào)分子的數(shù)量隨著菌體濃度變化而變化，不同濃度的信號(hào)分子對(duì)基因的表達(dá)有著不同的調(diào)控，從而導(dǎo)致群體顯現(xiàn)出與單個(gè)菌體不同的表達(dá)的一種生理活動(dòng)。群體感應(yīng)使得細(xì)菌可以更好的應(yīng)對(duì)外界環(huán)境，各類微生物均存在群體感應(yīng)這一現(xiàn)象[2]。常見(jiàn)的QS信號(hào)分子有：自體誘導(dǎo)多肽（autoinducing peptides，AIPs）、N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類（N-acyl-homoserinelactones，AHLs）、自體誘導(dǎo)物2（autoinduction-2，AI-2）、自體誘導(dǎo)物3（autoinduction-3，AI-3）[3]。AIPs是種內(nèi)群體感應(yīng)信號(hào)分子，首先通過(guò)腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結(jié)合盒（ATPbinding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被釋放到細(xì)胞體外，待其在體外積累到一定濃度時(shí)，調(diào)節(jié)胞內(nèi)受體蛋白，受體蛋白結(jié)合脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄表達(dá)[4]。AHLs含有一個(gè)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的內(nèi)酯環(huán)和一個(gè)可變的酰基側(cè)鏈，是最普遍的一類信號(hào)分子[5]，其種類較多，但其調(diào)控表達(dá)的機(jī)制大致相同。AI-2在細(xì)菌中普遍存在，為雙五圓環(huán)結(jié)構(gòu)，主要作用于細(xì)菌間的交流[6]。AI-3也是種間信號(hào)分子，僅存在于革蘭氏陰性菌，到目前為止還不曾在革蘭氏陽(yáng)性菌中被發(fā)現(xiàn)過(guò)[3]。

二酮哌嗪（diketopiperazine，DKPs）化合物，是最新研究發(fā)現(xiàn)的信號(hào)分子。DKPs有兩個(gè)氫鍵給體與受體，保證了抗菌性、抗氧化活性等生物、藥理活性[7]。因此，DKPs的發(fā)現(xiàn)為革蘭氏陰性菌的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。到目前為止，能夠產(chǎn)生DKPs的微生物中，90%都是革蘭氏陰性菌，另外在一些真菌中也有發(fā)現(xiàn)[8]。DKPs具有許多重要的生物活性，近期DKPs還被發(fā)現(xiàn)能夠激活或者競(jìng)爭(zhēng)性抑制受體蛋白QSLux[9]，DKPs與LuxR型蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)QS系統(tǒng)[10-11]。顧清清等[12]在大黃魚(yú)特定腐敗細(xì)菌海希瓦氏菌（Shewanella baltica）OS185中檢測(cè)到了DKPs，發(fā)現(xiàn)DKPs可以調(diào)控細(xì)菌的腐敗能力。GU Q Q等[13]發(fā)現(xiàn)，在波羅的海希瓦氏菌中，DKPs作為信號(hào)分子，也能促進(jìn)腐敗。李田田[14]就萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）的抑菌物對(duì)DKPs引起腐敗菌致腐能力的抑制作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)信號(hào)分子DKPs對(duì)5種腐敗菌的生長(zhǎng)、生物被膜、胞外多糖含量及泳動(dòng)性都有促進(jìn)作用。

目前，抑菌劑根據(jù)成分主要可以分為化學(xué)抑菌劑和天然抑菌劑，化學(xué)抑菌劑價(jià)格低廉、作用快，但是存在很大的弊端，化學(xué)藥品都存在一定的毒性，長(zhǎng)時(shí)間食用，對(duì)人體會(huì)造成不可避免的危害。天然抑菌劑具有無(wú)毒性、安全性、作用范圍廣等諸多優(yōu)點(diǎn)[15]，其中，微生物抑菌劑作為目前食品中的新型抑菌劑，具有很好的研究前景。國(guó)內(nèi)外關(guān)于微生物抑菌物質(zhì)的研究主要集中于乳酸菌和芽孢菌，芽孢菌能產(chǎn)生具有高效抑菌作用的代謝產(chǎn)物（如脂肽、細(xì)菌素、肽類抗生素等）[3]，在果蔬保鮮防腐開(kāi)發(fā)方面具有很好的應(yīng)用前景。因此，本研究首先考察了5種腐敗病原菌產(chǎn)生信號(hào)分子DKPs能力，然后考察不同理化因子及山西老陳醋源萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)5種腐敗病原菌產(chǎn)生信號(hào)分子DKPs能力的影響，最后考察萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)抑制草莓菌腐敗群體感應(yīng)的能力，以期為微生物抑菌劑在果蔬貯藏的廣泛應(yīng)用、對(duì)微生物抑制劑的前景和開(kāi)發(fā)價(jià)值提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

山西老陳醋源萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）SAV-CP 297、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 8739NA、沙門氏菌（Salmonella）CMCC 50041-16、志賀氏菌（Shigella）ATCC 12022、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19114和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538：均保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室；新鮮草莓：市售。

1.1.2 試劑

腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、蛋白胨（生物試劑）、抗壞血酸（分析純）、硫代巴比妥酸（分析純）、三氯乙酸（分析純）：西亞化學(xué)科技有限公司；DKPs cycLo-（L-Pro-L-Phe）標(biāo)準(zhǔn)品（生物試劑）：北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KH22R高速冷凍離心機(jī)：萊州辰達(dá)化工機(jī)械有限公司；Trace1300氣相色譜-TraceISQ質(zhì)譜（gas chromatgraphy mass spectrometrometry，GC-MS）分析儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；XK96渦旋儀：江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；RE201D-真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市英峪儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的測(cè)定

將大腸桿菌ATCC8739NA、沙門氏菌CMCC 50041-16、志賀氏菌ATCC 12022、單增李斯特菌ATCC 19114和金黃色葡萄球菌ATCC 6538 5株病原菌分別接種于1 mL BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h進(jìn)行活化后，按5%（V/V）的接種量分別接種于50 mL的BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，10 000 r/min離心10 min，分別取40 mL上清液，用等體積氯仿萃取3次，收集有機(jī)相，用等體積超純水清洗有機(jī)相一次后37 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，分別用氯仿重新溶解上述蒸發(fā)瓶中的殘留物，定容至1 mL，0.45 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾，進(jìn)行GC-MS分析[16-17]。

1.3.2 不同理化因子對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的影響

將活化好的5株病原菌按5%（V/V）的接種量分別接種于裝有不同NaCl含量（0.5%、1.5%、2.5%、3.5%）、不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的50 mL的BHI液體培養(yǎng)基中，在不同溫度（10 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、45 ℃），160 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，10 000 r/min離心10 min，取上清液40 mL，用等體積氯仿萃取3次，收集有機(jī)相，用等體積超純水清洗有機(jī)相一次后37 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，分別用氯仿重新溶解上述蒸發(fā)瓶中的殘留物，定容至1 mL，0.45 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾，進(jìn)行GC-MS分析[16-17]。

1.3.3 萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的測(cè)定

（1）萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297無(wú)細(xì)胞提取濃縮液的制備

按5%（V/V）的接種量將萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297接種至100 mL的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h，然后10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清，用6.0 mol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)整至7.0，82 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 mL，可得萎縮芽孢桿菌CP 297的無(wú)細(xì)胞提取濃縮液（cell-free extract，CFE（5×））。

（2）萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的測(cè)定

將活化的5株病原菌按5%（V/V）的接種量分別接種于50 mL的BHI液體培養(yǎng)基中，加入5%（V/V）的CFE（5×），分別于37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，10 000 r/min離心l0 min，取上清液40 mL，用等體積氯仿萃取3次，收集有機(jī)相，用等體積超純水清洗有機(jī)相一次后37 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，分別用氯仿重新溶解上述蒸發(fā)瓶中的殘留物，定容至1 mL，0.45 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾，進(jìn)行GC-MS分析[16-17]。

1.3.4 萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)病原菌群體感應(yīng)的抑制

（1）萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素的制備

按5%（V/V）的接種量將萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297接種至100 mL的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h，然后10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清，用6.0 mol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)整至7.0，82 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 mL，將其置于燒杯內(nèi)，加入硫酸銨，充分溶解，待其飽和度達(dá)到80%，置于4 ℃冰箱，存放一夜，4 000 r/min條件下離心20 min，保留沉淀，采用5 mL（pH=7.2）的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）復(fù)溶，透析除鹽，經(jīng)濃縮真空冷凍干燥后得萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素粗提物。

（2）病原菌混合液的制備

按3%（V/V）的接種量將5株病原菌分別接種至100 mL的BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)12 h，然后10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取菌體細(xì)胞，以無(wú)菌0.1%蛋白胨水洗滌2次，通過(guò)無(wú)菌水重懸，使細(xì)胞濃度達(dá)到104CFU/mL，等體積混合5種病原菌菌懸液。

（3）萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素在草莓保鮮貯藏中的應(yīng)用

新鮮草莓放在無(wú)菌平皿中（直徑9 cm），采用容量為50 mL的小噴壺將每顆草莓分別按表1中的處理方法均勻噴施，之后在超凈臺(tái)無(wú)菌風(fēng)吹干后覆蓋保鮮膜，置于4 ℃冰箱中，每天觀察記錄其狀態(tài)，并按照文獻(xiàn)[18]的方法測(cè)定菌落總數(shù)與5株病原菌菌落數(shù)，按照文獻(xiàn)[17]測(cè)定草莓失重率、可溶性固形物、總糖、總酸、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、細(xì)胞膜通透性。

表1 新鮮草莓的不同處理方式Table 1 Different treatments of fresh strawberry

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌產(chǎn)信號(hào)分子能力的測(cè)定

5種病原菌培養(yǎng)上清液中信號(hào)分子的相對(duì)含量見(jiàn)圖1。由圖1可知，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單增李斯特菌產(chǎn)cyclo-（L-Pro-L-Leu）的相對(duì)含量最高，分別為11.94%、12.55%、17.38%、7.31%、12.14%，說(shuō)明志賀氏菌產(chǎn)cyclo-（L-Pro-L-Leu）的能力明顯高于其他4株病原菌；產(chǎn)cyclo-（L-Pro-L-Gly）的相對(duì)含量最低，分別為0.58%、0.98%、0.45%、0.98%、0.20%，單增李斯特菌產(chǎn)cyclo-（L-Pro-L-Gly）的能力明顯低于其他4株菌。另外5株病原菌產(chǎn)cyclo-（L-Pro-L-Phe）的相對(duì)含量差距不大，分別為1.26%、1.24%、1.42%、1.44%和1.43%。

圖1 5種病原菌產(chǎn)信號(hào)分子二酮哌嗪能力的測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination results of diketopiperazine producing ability of 5 pathogenic bacteria

2.2 不同理化因子對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的影響

2.2.1 NaCl含量對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的影響

NaCl含量對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的影響見(jiàn)表2。由表2可知，病原菌分泌信號(hào)分子DKPs的含量及種類均受到NaCl含量的影響，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌在0.5%NaCl條件下有3種類型的信號(hào)分子DKPs，在1.5%NaCl、2.5%NaCl、3.5%NaCl條件下只有cyclo-（L-Pro-L-Leu）、cyclo-（L-Pro-L-Phe）2種類型的信號(hào)分子DKPs，并且隨著NaCl含量的增加，各類DKPs信號(hào)分子的相對(duì)含量呈下降趨勢(shì)；沙門氏菌、志賀氏菌在0.5%NaCl和1.5%NaCl條件下有3種類型的信號(hào)分子DKPs，在2.5%NaCl和3.5%NaCl條件下只有cyclo-（L-Pro-L-Leu）、cyclo-（L-Pro-L-Phe）2種類型的DKPs信號(hào)分子，并且隨著NaCl含量的增加，各類信號(hào)分子DKPs的相對(duì)含量呈下降趨勢(shì)；綜上所述，在高鹽環(huán)境下，病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs的相對(duì)含量均有所降低。李婷婷等[19]檢測(cè)了不同含鹽量下嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）產(chǎn)信號(hào)分子的情況，結(jié)果顯示當(dāng)含鹽量為25 g/L時(shí)，A.hydrophila產(chǎn)生的信號(hào)分子的濃度最高；孫秀嬌等[20]以NaCl含量為變量，對(duì)凡納濱對(duì)蝦源不動(dòng)桿菌M1分泌AHLs的情況進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含鹽量為0.5%～2.0%時(shí)，菌株M1生長(zhǎng)會(huì)受到影響，分泌AHLs的能力并無(wú)明顯差異；當(dāng)含鹽量為3.0%～5.0%時(shí)，菌株M1分泌AHLs的能力明顯變強(qiáng)。在本試驗(yàn)中，0.5%的NaCl含量條件下5株病原菌分泌DKPs信號(hào)分子的能力最強(qiáng)，隨著NaCl含量的提高，細(xì)菌分泌DKPs信號(hào)分子的能力不斷減弱，因而認(rèn)為，高含鹽量不利于5株病原菌分泌信號(hào)分子DKPs。

表2 NaCl含量對(duì)5株病原菌產(chǎn)信號(hào)分子二酮哌嗪能力的影響Table 2 Effect of NaCl content on the ability of 5 pathogenic bacteria producing signal molecule diketopiperazine

2.2.2 pH值對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的影響

pH值對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的影響見(jiàn)表3。由表3可知，病原菌分泌信號(hào)分子DKPs的種類和含量受pH值的影響，5種病原菌在pH=7的條件下均分泌3類信號(hào)分子DKPs，且信號(hào)分子含量較高。大腸桿菌、志賀氏菌和單增李斯特菌在pH=4、pH=5、pH=6條件下只能分泌cyclo-（L-Pro-L-Leu）和cyclo-（L-Pro-L-Phe）2類信號(hào)分子DKPs，在pH=7、pH=8條件下可以分泌3類信號(hào)分子DKPs，在pH=9條件下，大腸桿菌和志賀氏菌分泌3類信號(hào)分子DKPs，單增李斯特菌只能分泌cyclo-（L-Pro-L-Leu）和cyclo-（L-Pro-L-Phe）2類信號(hào)分子DKPs，并且pH值對(duì)信號(hào)分子DKPs的相對(duì)含量有較大影響，在pH=7時(shí)，3類信號(hào)分子的相對(duì)含量均達(dá)到最大；金黃色葡萄球菌、沙門氏菌在pH=4、pH=5條件下只能分泌cyclo-（L-Pro-L-Leu）、cyclo-（L-Pro-L-Phe）2類信號(hào)分子DKPs，在pH=6、pH=7、pH=8時(shí)分泌3類信號(hào)分子DKPs，在pH=9時(shí)，金黃色葡萄球菌分泌3類信號(hào)分子DKPs，沙門氏菌只能分泌cyclo-（L-Pro-L-Leu）、cyclo-（L-Pro-L-Phe）2類信號(hào)分子DKPs，并且pH值對(duì)其分泌信號(hào)分子DKPs的相對(duì)含量有較大影響，3類信號(hào)分子在pH=7時(shí)的相對(duì)含量均最大，在酸性或堿性環(huán)境下，病原菌的3類信號(hào)分子的相對(duì)含量均有所降低，但在堿性環(huán)境下病原菌分泌信號(hào)分子DKPs能力較酸性條件下強(qiáng)。馬艷等[21]也證實(shí)菌株生長(zhǎng)環(huán)境的pH值過(guò)低或過(guò)高均能夠抑制微生物生物被膜的形成，其發(fā)現(xiàn)當(dāng)環(huán)境pH為7時(shí)，大腸桿菌分泌群體感應(yīng)信號(hào)分子能力最強(qiáng)。孫秀嬌等[20]也研究發(fā)現(xiàn)，pH為7.0的中性條件下凡納濱對(duì)蝦源不動(dòng)桿菌M1分泌AHLs信號(hào)分子能力最強(qiáng)。酸性或堿性條件都不利于生物被膜的形成[22-23]。

表3 pH值對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子二酮哌嗪能力的影響Table 3 Effect of pH on the ability of 5 pathogenic bacteria producing signal molecule diketopiperazine

2.2.3 溫度對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的影響

溫度對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的影響見(jiàn)表4。由表4可知，5株病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs受溫度的影響，信號(hào)分子DKPs種類未受到影響，仍有3類信號(hào)分子DKPs，但是溫度對(duì)信號(hào)分子DKPs的相對(duì)含量有較小的影響。隨著溫度的升高，大腸桿菌分泌3類信號(hào)分子DKPs的相對(duì)含量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度高于30 ℃之后，信號(hào)分子的相對(duì)含量開(kāi)始降低；金黃色葡萄球菌分泌3類DKPs信號(hào)分子的相對(duì)含量在37 ℃時(shí)達(dá)到最大值，之后其相對(duì)含量也呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。而志賀氏菌、沙門氏菌和單增李斯特菌分泌3類信號(hào)分子DKPs的相對(duì)含量則一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。綜上所述，隨著溫度的升高，病原菌產(chǎn)3類信號(hào)分子相對(duì)含量均有所升高，達(dá)到一定溫度后，3類信號(hào)分子相對(duì)含量均有所下降。

表4 溫度對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子二酮哌嗪能力的影響Table 4 Effect of temperature on the ability of 5 pathogenic bacteria producing signal molecule diketopiperazine

2.3 萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的影響

萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，5株病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs的能力均會(huì)受萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素的影響。通過(guò)萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素處理，志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及單增李斯特菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs的種類受到了影響，只產(chǎn)生了cyclo-（L-Pro-LLeu）和cyclo-（L-Pro-L-Phe）2類信號(hào)分子DKPs，并且各信號(hào)分子的相對(duì)含量均有所下降；沙門氏菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs的種類未受到影響，但各信號(hào)分子的相對(duì)含量均有所降低。在這5種病原菌中，萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素處理對(duì)大腸桿菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs的含量影響最大，對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs的含量影響較小。芽孢菌及芽孢菌細(xì)菌素對(duì)腐敗病原菌產(chǎn)信號(hào)分子的降解及作用機(jī)制非常復(fù)雜，還需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

圖2 萎縮芽孢桿菌無(wú)細(xì)胞提取液對(duì)病原菌產(chǎn)信號(hào)分子二酮哌嗪能力的影響Fig.2 Effect of Bacillus atrophaeus cell free extract on the ability of diketopiperazine produced by spoilage bacteria

2.4 萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)病原菌群體感應(yīng)抑制的應(yīng)用研究

在水果的貯藏過(guò)程中，微生物的數(shù)量不僅決定著其貯藏時(shí)間，也關(guān)系著水果的品質(zhì)，因此控制微生物的生長(zhǎng)對(duì)水果產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益有著重要的意義。萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)草莓中菌落總數(shù)及5株病原菌菌落數(shù)的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，各處理組中草莓的菌落總數(shù)與5株病原菌的對(duì)應(yīng)菌落數(shù)均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，同時(shí)噴施信號(hào)分子DKPs和病原菌與只添加病原菌的草莓相比，菌落總數(shù)及5株病原菌的菌落數(shù)均明顯增加，噴施了病原菌及萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素的草莓的菌落總數(shù)及5株病原菌的菌落數(shù)最低，說(shuō)明萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素的噴施對(duì)病原菌起到了抑制作用。噴施了病原菌、信號(hào)分子DKPs及萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素的草莓，其菌落總數(shù)及5株病原菌的菌落數(shù)均明顯低于只噴施了病原菌和信號(hào)分子DKPs的草莓。結(jié)果表明，外源信號(hào)分子對(duì)草莓腐敗病原微生物的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素的噴施抑制了信號(hào)分子DKPs對(duì)草莓病原微生物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。另外，噴施了病原菌、信號(hào)分子DKPs及萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素的草莓和噴施了病原菌及萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素的草莓的菌落總數(shù)低于只噴施無(wú)菌水的草莓，說(shuō)明萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素在抑制噴施的病原菌的同時(shí)，也抑制了草莓在貯藏過(guò)程中其他自然生長(zhǎng)微生物的生長(zhǎng)，但是對(duì)比5種病原菌的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌的抑制作用更明顯，這與2.3中，萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)5種腐敗病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs能力影響結(jié)果相呼應(yīng)。

圖3 萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)草莓貯藏期間微生物的影響Fig.3 Effect of Bacillus atrophaeus SAV-CP 297 bacteriocins on microorganisms of strawberry during storage

失重是指果蔬在存儲(chǔ)過(guò)程中的自然損耗，其代表了果蔬的水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損耗，因此控制失重率對(duì)果蔬的保鮮研究有著重要意義。MDA會(huì)造成膜的損傷[24]，在果蔬貯存實(shí)驗(yàn)中，可以通過(guò)測(cè)定其含量來(lái)檢測(cè)果蔬膜系統(tǒng)的損傷程度。在果蔬的組織細(xì)胞中，細(xì)胞膜滲透性的改變會(huì)導(dǎo)致該膜內(nèi)外電解質(zhì)以及電導(dǎo)率改變，因此細(xì)胞膜的滲透率決定了果蔬的貯藏品質(zhì)[25]。由圖4可知，噴灑病原菌混合液后，隨著貯藏時(shí)間增加，草莓的失重率和相對(duì)滲透率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；可溶性固形物和MDA含量呈現(xiàn)波動(dòng)變化；可滴定酸在儲(chǔ)藏時(shí)呈先上升后下降的變化趨勢(shì)；總糖含量則呈下降趨勢(shì)。

圖4 萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素對(duì)草莓貯藏期間理化指標(biāo)的影響Fig.4 Effect of Bacillus atrophaeus SAV-CP 297 bacteriocins on physical and chemical indicators of strawberry during storage

隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，噴施了病原菌及信號(hào)分子DKPs的草莓與只噴施病原菌的草莓各物質(zhì)含量的變化趨勢(shì)一致，但含量出現(xiàn)差異，噴施了病原菌及信號(hào)分子DKPs的草莓失重率明顯偏高，可溶性固形物、MDA、總糖、可滴定酸含量均降低，其中總糖和可滴定酸含量下降的變化趨勢(shì)更明顯，作為果實(shí)衰老重要指標(biāo)的膜透性的上升趨勢(shì)最快。噴施了病原菌、信號(hào)分子DKPs及萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素的草莓與噴施了病原菌及信號(hào)分子DKPs草莓相比，失重率、可溶性固形物、MDA含量均降低，總糖、可滴定酸含量及膜透性偏高。結(jié)果可知，外源信號(hào)分子DKPs的噴施使草莓的總糖、總酸的含量下降趨勢(shì)和膜透性上升趨勢(shì)皆變快，提高了MDA的含量，萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素的噴施減緩了草莓的總糖、總酸含量的下降趨勢(shì)和膜透性上升趨勢(shì)，降低了MDA的含量。

過(guò)氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)活性很高的酶。在逆境條件下，POD與超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）協(xié)同作用，清除植物體內(nèi)多余自由基，提高其抗逆性[26]。作為一種末端氧化酶，PPO將電子直接傳遞給分子氧。在植物體內(nèi)，PPO催化酚類化合物，參與黑色素的生成，使得果蔬褐變[27]。由圖4亦可知，各處理組的POD活性、PPO酶活均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，分析原因是在草莓的保鮮過(guò)程中，激發(fā)了草莓本身的防御反應(yīng)，導(dǎo)致草莓POD、PPO活性的升高，使其提高對(duì)環(huán)境的抗逆行，延緩了草莓的酶促褐變及腐爛；而隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，草莓代謝減弱，酚類物質(zhì)減少，以及PPO催化褐變產(chǎn)物的逐漸積累，在一定程度上抑制了PPO的活性，因此各處理組的草莓的PPO活性在貯藏后期逐漸下降[28]。草莓儲(chǔ)藏前4天，噴施了病原菌及信號(hào)分子DKPs的草莓與只噴施病原菌的草莓相比，POD、PPO活性明顯偏高，同時(shí)噴施了病原菌、信號(hào)分子DKPs及萎縮芽孢桿菌SAV-CP 297細(xì)菌素的草莓與噴施了病原菌及信號(hào)分子DKPs草莓相比，POD、PPO活性明顯偏低。結(jié)果可知，外源信號(hào)分子DKPs的噴施使得草莓在儲(chǔ)藏過(guò)程中POD酶活及PPO酶活降低。

3 結(jié)論

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、單增李斯特菌均能產(chǎn)生cyclo-（L-Pro-L-Gly）、cyclo-（L-Pro-L-Leu）和cyclo-（L-Pro-L-Phe）3種類型的信號(hào)分子DKPs。隨著NaCl含量的增加，信號(hào)分子的種類和含量均減少；隨著pH、溫度的升高，信號(hào)分子的含量均呈先升高后下降的趨勢(shì)，其種類在pH升高時(shí)增加，在溫度升高時(shí)不變。B.atrophaeusSAV-CP 297細(xì)菌素可以明顯抑制病原菌產(chǎn)信號(hào)分子DKPs化合物的能力。與利用外源信號(hào)分子DKPs及病原菌混合液處理的草莓相比，將萎縮芽孢桿菌CP297細(xì)菌素應(yīng)用到草莓貯藏保鮮中，降低了菌落總數(shù)和5株病原菌菌落數(shù)，減緩了草莓總糖、總酸含量的下降趨勢(shì)和膜透性上升趨勢(shì)，降低了MDA的含量，說(shuō)明可通過(guò)抑制病原菌群體感應(yīng)信號(hào)分子DKPs而延緩貯藏期間草莓的腐敗速度，達(dá)到良好的保鮮效果。