白雪 張宏賢 周倩倩 馬寧 閆文宏 張晶晶 崔霞

抽動障礙是兒童時期常見的一種慢性神經(jīng)精神障礙性疾病。在中國，學(xué)齡期兒童抽動障礙的患病率已達(dá)到6.1%，近年來其患病率呈明顯上升趨勢[1]。中藥因其較好的療效和安全性在抽動障礙的治療方面發(fā)揮著積極的作用。健脾止動湯是國家名老中醫(yī)藥專家王素梅教授的經(jīng)驗處方，在臨床上取得了確切的療效[2]，于2015年獲得國家專利(專利號：CN201510198368.8)。

抽動障礙屬于神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，其發(fā)生可能與神經(jīng)元的生長及分化、突觸的生長及修剪等有關(guān)。課題組前期發(fā)現(xiàn)抽動障礙存在谷氨酸系統(tǒng)功能亢進(jìn)[3]，而谷氨酸的高表達(dá)在腦發(fā)育的后期或病理狀態(tài)下表現(xiàn)為神經(jīng)毒性，對神經(jīng)元存在較強(qiáng)的破壞性，而神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)發(fā)育中起著重要作用[4]。故本研究采用IDPN腹腔注射聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激因素制備慢性束縛應(yīng)激抽動障礙大鼠模型[5]，觀察健脾止動湯對模型大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元及神經(jīng)營養(yǎng)因子水平的影響，為進(jìn)一步研究健脾止動湯治療抽動障礙的作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

健康離乳3周齡雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量40～60 g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)5天，自由飲食，溫度(22±2)℃，相對濕度40～70%，于中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物

健脾止動湯配方顆粒(太子參10 g、鉤藤10 g、茯苓10 g、炒白術(shù)10 g、半夏6 g、陳皮6 g、川芎6 g、龍膽草3 g、當(dāng)歸10 g、防風(fēng)6 g，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院顆粒藥房，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供)，配成溶液(1 mL藥液中約含1.6 g生藥)，4℃冰箱存用；鹽酸硫必利片(泰必利，規(guī)格：100 mg，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號：20191208)，用生理鹽水配成混懸液(1 mL藥液中約含有2.1 mg原藥)。

1.3 主要實驗試劑與儀器

IDPN[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，貨號：317306]；大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Rat BDNF)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號：20200719.60239R)、大鼠神經(jīng)生長因子(Rat NGF)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號：20200719.60150R)、大鼠胰島素樣生長因子-1(Rat IGF-1)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號：20200719.60059R)，總蛋白試劑盒(批號：20211230.30002)，均購于北京瑞格博科技發(fā)展有限公司。尼氏(Nissl)染液(甲苯胺藍(lán)法)(上海源葉生物科技有限公司，貨號：R30434)；Unicel DxC 600 Synchron 全自動生化分析儀(美國Beckmancoulter)。

1.4 動物分組及造模

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組12只和造模組36只?？瞻捉M予腹腔注射生理鹽水1 mL/(100 g·d)，每日1次，連續(xù)7天；造模組予腹腔注射IDPN[250 mg/kg，1 mL/(100 g·d)]，每日1次，連續(xù)7天。同時予慢性束縛法造模，將大鼠放置于束縛裝置中，每日連續(xù)束縛3小時(8:00-11:00 am)，連續(xù)21天。束縛期間造模組及空白組大鼠均禁食水。第22天進(jìn)行刻板運動、曠場實驗等行為學(xué)檢測，造模組表現(xiàn)出嚙齒類動物刻板行為的典型特征，如旋轉(zhuǎn)運動、頭部垂直或水平方向運動，表示模型誘導(dǎo)成功。根據(jù)刻板運動評分及曠場實驗評分結(jié)果，將造模成功的模型大鼠隨機(jī)分為模型組、硫必利組、健脾止動湯組各12只。

1.5 給藥方法

造模第23天開始給藥，空白組及模型組予生理鹽水灌胃，硫必利組予鹽酸硫必利混懸液灌胃(1 mL藥液中約含2.1 mg原藥)，健脾止動湯組予健脾止動湯溶液灌胃(1 mL藥液中約含1.6 g生藥)，均按1 mL/(100 g·d)灌胃，每日1次，連續(xù)4周。

1.6 指標(biāo)檢測

末次用藥后，每組各隨機(jī)選取5只大鼠斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，制成6 μm的石蠟切片，進(jìn)行尼氏染色。利用Lecia圖文分析系統(tǒng)在高倍顯微鏡下觀察皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞及尼氏小體形態(tài)結(jié)構(gòu)及數(shù)目的變化。

末次用藥后，每組各隨機(jī)選取7只大鼠斷頭取腦，在冰盒上迅速剝離大鼠前額葉皮質(zhì)，置于凍存管中，液氮凍存后，存放于-80℃冰箱中，以待檢測。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測，用酶標(biāo)儀以450 nm波長檢測其吸光度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 健脾止動湯對慢性束縛應(yīng)激抽動障礙大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元尼氏小體的影響

尼氏染色結(jié)果顯示，空白組前額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，排列緊密，胞漿中尼氏小體豐富，可見藍(lán)紫色斑塊狀尼氏小體。與空白組相比，模型組神經(jīng)元排列稀疏，細(xì)胞間隙增大，胞漿內(nèi)尼氏小體表達(dá)減弱，顏色變淺，部分明顯溶解、消失，數(shù)量明顯減少(P<0.05)；與模型組相比，硫必利組神經(jīng)元排列相對緊密，細(xì)胞間隙略減少，胞漿內(nèi)尼氏小體表達(dá)略增強(qiáng)，顏色稍有加深，數(shù)量略增多(P>0.05)，健脾止動湯組神經(jīng)元排列緊密，細(xì)胞間隙減小，胞漿內(nèi)尼氏小體表達(dá)豐富，顏色加深，數(shù)量明顯增多(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組慢性束縛應(yīng)激抽動障礙大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元尼氏小體表達(dá)情況(尼氏染色，×400)

表1 各組慢性束縛應(yīng)激抽動障礙大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元尼氏小體表達(dá)情況

2.2 健脾止動湯對慢性束縛應(yīng)激抽動障礙大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響

與空白組大鼠相比，模型組大鼠皮質(zhì)中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)含量有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，硫必利組大鼠皮質(zhì)中BDNF含量有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，健脾止動湯組大鼠皮質(zhì)中BDNF含量顯著升高(P<0.05)。與空白組相比，模型組大鼠皮質(zhì)中胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)含量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，硫必利組、健脾止動湯組大鼠皮質(zhì)中IGF-1含量顯著升高(P<0.05)。與空白組相比，模型組大鼠皮質(zhì)中神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)含量升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，健脾止動湯組大鼠皮質(zhì)中NGF含量顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組慢性束縛應(yīng)激抽動障礙大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)情況

3 討論

抽動障礙在中醫(yī)古籍中沒有相應(yīng)的病名，但根據(jù)其癥狀特點，可歸于“肝風(fēng)”“瘛瘲”“慢驚風(fēng)”的范疇。健脾止動湯是王素梅教授的經(jīng)驗用方。王教授認(rèn)為抽動障礙的主要病機(jī)為脾虛肝亢、風(fēng)痰內(nèi)擾,結(jié)合小兒“肝常有余、脾常不足”的生理特點及五行生克理論，認(rèn)為“土衰則木橫，木橫則土益衰”，土虛不能制約肝木，土虛風(fēng)動，出現(xiàn)運動性抽動的癥狀，肝風(fēng)夾痰上擾可見發(fā)聲性抽動的表現(xiàn)。因此采用扶土抑木之法，健脾平肝，由六君子湯合瀉青丸加減化裁，創(chuàng)立健脾止動湯。取六君子湯健脾益氣、燥濕化痰，達(dá)到實脾以抑肝木之效；用瀉青丸清肝瀉火，以平抑肝風(fēng)；二者合用以達(dá)到扶土抑木之功。肝與先天腎為肝腎同源關(guān)系，以藏瀉互用為前提，肝疏泄功能正常，腎精充足才能充髓養(yǎng)腦；且肝脈絡(luò)于腦。而脾為氣血生化之源，可升清陽上達(dá)以榮腦。前期研究發(fā)現(xiàn)健脾止動湯可以改善患兒抽動癥狀，提高患兒血清中BDNF含量[6]，同時也可改善慢性束縛應(yīng)激抽動障礙大鼠的刻板行為及學(xué)習(xí)記憶能力[7]。

目前神經(jīng)解剖與功能影像學(xué)研究顯示，抽動障礙的發(fā)病與大腦皮質(zhì)—基底節(jié)—丘腦—皮質(zhì)神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)育異常相關(guān)，前額葉皮質(zhì)是其重要環(huán)節(jié)[8-9]。臨床研究顯示抽動障礙患兒存在前額葉皮質(zhì)厚度變薄[10-11]，通過前額葉局部的經(jīng)顱磁治療可用于本病的治療[12]。尼氏小體是由神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分布其間的游離核糖體構(gòu)成，用于合成更新細(xì)胞器所需的結(jié)構(gòu)蛋白、合成神經(jīng)遞質(zhì)所需的酶類以及神經(jīng)肽[13]。當(dāng)尼氏小體正逐步減少甚至消失時，說明神經(jīng)細(xì)胞在遭受損傷。尼氏染色結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠均可見前額葉皮質(zhì)區(qū)尼氏小體顯著減少；與模型組相比，健脾止動湯組尼氏小體表達(dá)顯著增多，提示模型組大鼠存在前額葉皮質(zhì)的神經(jīng)元損傷，健脾止動湯具有保護(hù)大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元的功能。

神經(jīng)營養(yǎng)因子能支持和調(diào)控神經(jīng)組織的生長發(fā)育，對受損區(qū)域的神經(jīng)元及其附屬結(jié)構(gòu)起到保護(hù)和修復(fù)作用。BDNF是體內(nèi)含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子，廣泛參與大腦的調(diào)節(jié)功能，包括運動、學(xué)習(xí)和記憶等。生物遺傳學(xué)和心理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[14]，BDNF Val66Met多態(tài)性是我國漢族人群抽動障礙的常見遺傳易感性，同時臨床發(fā)現(xiàn)[15]較低濃度的血清BDNF多提示抽動障礙患兒遠(yuǎn)期預(yù)后效果較差。BDNF與其受體肌球蛋白相關(guān)激酶B結(jié)合，引起受體磷酸化，進(jìn)而激活神經(jīng)元的下游細(xì)胞內(nèi)信號，抑制皮質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元中谷氨酸引起的神經(jīng)毒性[16]。本研究結(jié)果顯示健脾止動湯組大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF較其他組升高，與課題組前期研究健脾止動湯可提高抽動障礙患兒血清中BDNF水平的結(jié)論相一致[6]。

IGF-1是一類具有類胰島素樣作用的生長因子、非選擇性神經(jīng)營養(yǎng)因子，參與情緒的控制與調(diào)節(jié)。在神經(jīng)系統(tǒng)中大腦皮層、海馬等區(qū)域可檢測到高水平的IGF-1[17]，而循環(huán)系統(tǒng)中70～90%的IGF-1由肝臟合成和分泌，受生長激素體調(diào)節(jié)，可通過血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)[18]。當(dāng)神經(jīng)元受損后腦組織需要大量的IGF-1，大量外周血中的IGF-1可通過血腦屏障進(jìn)入腦組織。研究發(fā)現(xiàn)IGF-1有促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞存活和增值的能力[17]。運動神經(jīng)障礙患者的腦脊液中IGF-1水平較健康對照組明顯降低[19]，而外源性IGF-1可降低抽動大鼠紋狀體內(nèi)氨基酸遞質(zhì)水平及凋亡蛋白的表達(dá)[20]。本研究結(jié)果提示模型組大鼠存在IGF-1分泌不足，而健脾止動湯可促進(jìn)模型鼠前額葉皮質(zhì)IGF-1的表達(dá)。

NGF是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，是交感神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元的生長和存活所必須的。血腦屏障對NGF具有選擇性通透作用，發(fā)生腦損傷時，NGF更容易透過血腦屏障，進(jìn)入腦組織中[21]。葛莉等[22]通過臨床分析130例抽動障礙患兒的血清NGF水平，發(fā)現(xiàn)患兒血清中NGF水平升高，且與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。而NGF及其受體在應(yīng)激相關(guān)的情緒障礙的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[23]，慢性應(yīng)激暴露可導(dǎo)致大鼠前額葉皮質(zhì)NGF水平顯著下降[24]。本研究結(jié)果顯示模型組前額葉皮質(zhì)NGF水平與空白組無明顯差異，與相關(guān)報道不一致。推測原因可能與慢性束縛應(yīng)激的暴露降低了抽動障礙大鼠前額葉皮質(zhì)NGF含量；也可能與慢性束縛應(yīng)激抽動障礙大鼠存在5-羥色胺水平升高有關(guān)[5]，因5-羥色胺可上調(diào)NGF的水平[25]。

本研究的局限性在于僅采用Elisa法對大鼠前額葉皮質(zhì)中相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量進(jìn)行測定，方法較為單一，且未對相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子的不同活化形式及受體進(jìn)行測定，樣本量較小。后期需增加樣本量，采用不同檢測方法，更加深入地研究其具體作用機(jī)制。

本研究初步驗證了健脾止動湯可提高大腦皮質(zhì)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，從而降低模型組大鼠神經(jīng)元的損傷，揭示了健脾止動湯可能是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子在前額葉的表達(dá)，減輕神經(jīng)元損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用，從而發(fā)揮抗抽動效應(yīng)。