王文萱 張云封 羅揚淦 廖晗婧 劉莉 張仕林 屠鵬飛 朱枝祥 李軍

血人參為豆科蝶形花亞科(Papilionoideae)木藍屬植物茸毛木藍IndigoferastachyodesLindl.的干燥根[1]，是貴州省少數(shù)民族特色苗藥。在《貴陽民間藥草》記載血人參具有“補血活血”的功效[2]；在《全國中草藥匯編》記載血人參具有“解表祛濕，止痛，止血”的功效，主治感冒咳嗽，頭痛，小兒痰哮，胃痛，黃疸，心絞痛，腰痛，子宮出血，乳癌初起，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，疔瘡，毒蛇咬傷[3]。然而，目前對血人參的現(xiàn)代藥理學(xué)研究資料十分缺乏，中醫(yī)臨床中對血人參的利用受到嚴重制約。

本研究前期實驗從血人參中提取分離了大量黃酮類化合物，通過初步生物活性篩選，發(fā)現(xiàn)從血人參中分離出的化合物異甘草素對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)巨噬細胞釋放一氧化氮(nitric oxides, NO)具有很強的抑制作用，可能對巨噬細胞和中性粒細胞的活化及炎癥反應(yīng)具有抑制作用。因此，本研究將利用LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞和原代中性粒細胞活化模型[4-5]，研究異甘草素的抗炎活性及其作用機制，以揭示血人參中發(fā)揮抗炎作用的有效成分及作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株和動物

小鼠巨噬細胞系RAW264.7，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心。8～10周齡雄性C57BL/6小鼠，動物合格證號：1100112011044776，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗試劑與儀器

血人參由貴州漢方藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李軍研究員鑒定為豆科蝶形花亞科木藍屬植物血人參真品；異甘草素由李軍課題組經(jīng)硅膠、Sephadex LH-20柱色譜和半制備高效液相色譜技術(shù)分離純化，純度大于95%。

胎牛血清(貨號35-081-CV)、DMEM細胞培養(yǎng)基(貨號10-013-CVR)、0.25 %胰蛋白酶(貨號25-053-CI)、青霉素和鏈霉素混合液(貨號30-002-CI)購自美國Corning公司；細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(貨號 C009S)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑(貨號A33254)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；氯仿、異丙醇購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；一氧化氮檢測試劑盒(貨號BR45002)購自北京佰瑞達生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號AT301-02)和實時熒光定量PCR試劑盒(貨號AQ141-02)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、巨噬細胞炎癥蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1, MIP-1α)、單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)和干擾素-β(interferon-β, IFN-β)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)等基因的實時熒光定量PCR引物購自上海生工生物工程有限公司；小鼠TNF-α(貨號3511-1H-6)和IL-6(貨號3361-1H-6)的酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immuno sorbed assay, ELISA)試劑盒購自瑞典Mabtech公司；小鼠MCP-1(貨號555260)的ELISA試劑盒購自美國BD公司；干擾素-β(interferon-β, IFN-β)(貨號DY8234-05)的ELISA試劑盒購自美國RD Systems公司。

超凈工作臺(型號SW-CJ-1FD)購自中國蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(型號MCO-18AIC)購自日本三洋公司；臺式低溫高速離心機(型號5424R)購自美國Eppendorf公司；實時熒光定量PCR儀(型號CFX96)購自美國Bio-Rad公司；多功能酶標儀(型號Enspire)購自美國PerkinElmer公司；化學(xué)發(fā)光成像儀(型號Amersham imager 680)購自美國通用電器公司。

1.3 異甘草素提取流程

血人參藥材(20 kg)干燥、粉碎后，依次用95%、70%、50%乙醇回流提取(每次溶劑120 L，回流2小時)，過濾，合并濾液，減壓濃縮得到總浸膏(3.2 kg)?？偨嘤?0%甲醇-水分散后，依次用正己烷、乙酸乙酯萃取，得到正己烷部位(20.2 g)、乙酸乙酯部位(945.4 g)和水部位(1628.0 g)。乙酸乙酯萃取部位(420 g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(1∶0→0∶1)梯度洗脫，TLC檢測，合并得到10個流分(Fr. A- Fr. J)。Fr. B(8.57 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，正己烷-乙酸乙酯(1∶0→0∶1)梯度洗脫得到11個流分(Fr. B1～Fr. B11)。Fr. B9(0.73 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫得到9個流分(Fr. B9a～Fr. B9i)。Fr. B9i(65.6 mg)經(jīng)半制備液相[乙腈-水(35∶65)]分離純化得到化合物異甘草素(41.4 mg，tR= 24分鐘)。

1.4 細胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細胞系RAW264.7，利用含10 %的胎牛血清、100 U/mL氨芐青霉素和100 μg/mL鏈酶素的DMEM高糖培養(yǎng)基在5 %的CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。

1.5 MTT法檢測血人參中異甘草素對巨噬細胞的細胞毒

取對數(shù)生長期RAW264.7細胞，調(diào)整細胞濃度到4×105/mL，接種細胞到96孔組織培養(yǎng)板中，100 μL/孔，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時；利用二甲基亞砜將異甘草素配制為20 mmol/L的儲備液，然后利用培養(yǎng)基進行梯度稀釋，將100 μL化合物溶液加入到給藥孔中，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時；然后從各孔中吸棄100 μL的細胞培養(yǎng)上清，在剩余細胞培養(yǎng)基中，加入MTT檢測液25 μL，至MTT終濃度0.5 mmol濃度，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時；再加入三聯(lián)液125 μL，室溫放置過夜，檢測570 nm吸光度(A)，計算化合物異甘草素對RAW264.7細胞的生長抑制率。

細胞生長抑制率 =(A對照組- A給藥組)/A對照組× 100%

1.6 Griess法檢測血人參中異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞分泌NO的影響

按照1.5所述的方法將細胞接種到96孔板里，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時；然后將異甘草素加入到給藥孔中，50 μL/孔，至終濃度為5、10、20、40 μmol/L，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)0.5小時，再在模型孔和給藥孔中加入50 μL的LPS至終濃度1 μg/mL，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。利用Griess法測定細胞培養(yǎng)上清中的NO代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽的濃度，以定量測定巨噬細胞釋放的NO。具體方法如下，取出96孔板，每孔吸取50 μL上清到新的96孔板中，然后分別加入50 μL的R1試劑和R2試劑，室溫反應(yīng)5分鐘后在540 nm處測得吸光度，根據(jù)標準曲線計算出樣品中的NO濃度。

1.7 實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)檢測血人參中異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞炎癥因子mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，調(diào)整細胞濃度為5×105/mL，接種到6孔板中，2 mL/孔，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時至細胞完全貼壁后，將異甘草素加入到給藥孔中，至終濃度為5、10、20、40 μmol。培養(yǎng)1小時后，將LPS加入到模型孔和給藥孔至終濃度1 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)6小時后，將上清棄去，底層的細胞加1 mL 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)制成細胞懸液，轉(zhuǎn)移到離心管中，離心得到沉淀，利用Trizol試劑裂解細胞，然后利用氯仿、異丙醇和乙醇提取細胞總RNA。

cDNA的制備：以提取的細胞總RNA為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備cDNA。反應(yīng)條件：42℃，30分鐘，85℃，10秒，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

qRT-PCR檢測：具體操作參照全式金實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1分鐘，然后進行95℃，5秒，60℃，40秒的循環(huán)反應(yīng)，擴增40個循環(huán)，并通過熔解曲線確證擴增反應(yīng)的特異性。最后利用各基因循環(huán)數(shù)和參照基因GAPDH的循環(huán)數(shù)計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR所用引物序列

1.8 ELISA法檢測血人參中異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞分泌炎癥因子的影響

按照1.6細胞培養(yǎng)的方法給藥刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)12小時后，收集細胞上清用于ELISA測定。

按ELISA試劑盒說明書，利用PBS將包被抗體稀釋后，加入到高吸附可拆卸96孔板中，100 μL/孔，4℃包被20小時，棄去包被液，利用PBS清洗3次；再加入封閉液室溫封閉4小時，利用PBS清洗3次。然后根據(jù)預(yù)實驗將收集到的細胞上清稀釋一定倍數(shù)后，加入到包被各種因子抗體的96孔板中，另外在標準品孔加入系列濃度的標準品，均為100 μL/孔，室溫孵育2小時后，利用含0.1 % 吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗板3次。再加入檢測抗體溶液，100 μL/孔，室溫孵育1小時后按上述方法洗板。然后加入辣根過氧化物酶標記的鏈酶親和素溶液，100 μL/孔，室溫孵育0.5小時后按上述方法洗板。然后加入TMB單組份顯色液，100 μL/孔，室溫反應(yīng)10分鐘，最后加入10%的磷酸水溶液終止顯色反應(yīng)。在450 nm波長測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算各組細胞上清中各種炎癥因子的濃度。

1.9 流式細胞術(shù)分析血人參中異甘草素對LPS誘導(dǎo)中性粒細胞活化的影響

通過頸椎脫臼將自由飲食適應(yīng)性飼養(yǎng)1周的C57BL/6小鼠處死，無菌取股骨骨髓細胞，裂解紅細胞后，利用含2 % FBS的IMDM培養(yǎng)基清洗并重懸骨髓細胞，加入DHR123至終濃度1 μmol，并調(diào)整細胞濃度至2.5×106/mL，將細胞接種到48孔板中，5×105/孔。在給藥孔中加入100 μL系列濃度異甘草素，37℃培養(yǎng)箱孵育15分鐘，然后加入100 μL的LPS至以下濃度，37℃培養(yǎng)箱孵育3小時；收集細胞，離心去上清，利用200 μL含0.2 %牛血清白蛋白的PBS重懸細胞，再加入50 μL的APC標記大鼠抗小鼠Ly6G抗體和PE標記大鼠抗小鼠CD11b抗體混合液，冰浴30分鐘，然后利用含0.2 %牛血清白蛋白的PBS清洗并重懸細胞，最后完成流式細胞測定，利用FlowJo分析Ly6G+中性粒細胞DHR123和CD11b的平均熒光強度。

1.10 Western Blot法分析血人參中異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞信號通路活化的調(diào)節(jié)作用

按照1.9所述方法鋪板給藥，分別在刺激30分鐘和3小時后收集細胞。利用RIPA細胞裂解液冰浴裂解細胞，4℃、12 000 g離心10分鐘，取上清液制備蛋白電泳樣本。然后經(jīng)過聚丙烯酰胺蛋白電泳分離蛋白，再利用電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；利用磷酸鹽緩沖溶液(tris buffered saline, TBS)緩沖液配制的5 %脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1小時，然后加入5 %脫脂牛奶配制的一抗4℃孵育過夜，利用含0.1 % 吐溫20的TBS洗膜3次；然后加入含0.1 % 吐溫20的TBS配制的二抗室溫孵育2小時，再利用含0.1 % 吐溫20的TBS洗膜3次；最后利用化學(xué)發(fā)光檢測儀器進行曝光分析。利用Quantity One 軟件定量分析蛋白條帶。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血人參中異甘草素對巨噬細胞的細胞毒性

首先，本研究利用MTT測定方法分析了異甘草素對巨噬細胞的細胞毒性。結(jié)果顯示，與對照組相比，異甘草素在80 μmol/L濃度對巨噬細胞存活有輕度的抑制作用，在40 μmol/L及其以下濃度無抑制作用，這表明該化合物在40 μmol/L以下濃度對巨噬細胞無顯著細胞毒。見表2。

表 2 異甘草素對巨噬細胞的細胞毒性

2.2 血人參中異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞釋放NO的影響

在完成異甘草素對巨噬細胞的細胞毒測定后，本研究進一步測定了其在無細胞毒劑量下對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞釋放NO的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS模型組能夠顯著刺激巨噬細胞釋放NO; 與模型組相比，異甘草素各劑量組均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細胞釋放NO。見表3。

表3 異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞釋放NO的影響

2.3 血人參中異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞炎癥因子mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

巨噬細胞表達和分泌的炎癥因子在促進炎癥反應(yīng)發(fā)生中發(fā)揮重要作用，本研究利用qRT-PCR分析了異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞炎癥因子mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果顯示LPS刺激能夠顯著增加巨噬細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、MIP-1α、MCP-1和IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄，異甘草素能夠劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子轉(zhuǎn)錄，特別是對IL-6、MCP-1和IFN-β的轉(zhuǎn)錄具有很強的抑制作用。見表4、表5。

表4 異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞炎癥因子mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

表5 異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞炎癥因子mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

2.4 血人參中異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞分泌炎癥因子的影響

在通過實時熒光定量PCR測定發(fā)現(xiàn)異甘草素對巨噬細胞炎癥因子轉(zhuǎn)錄的抑制作用之后，本研究繼續(xù)利用ELISA測定研究異甘草素對巨噬細胞分泌的部分炎癥因子的影響。結(jié)果顯示LPS刺激能夠顯著增加巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6、MCP-1和IFN-β，異甘草素能夠呈劑量依賴性抑制MCP-1和IFN-β的分泌。綜合qRT-PCR和ELISA的結(jié)果，異甘草素能夠呈劑量依賴性抑制炎癥因子的表達和分泌，特別是對MCP-1和IFN-β的表達和分泌具有很強的抑制作用。見表6。

表6 異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞分泌炎癥因子的影響

2.5 人參中異甘草素對LPS誘導(dǎo)中性粒細胞活化的影響

在發(fā)現(xiàn)異甘草素對巨噬細胞炎癥因子轉(zhuǎn)錄和分泌的抑制作用之后，本研究繼續(xù)利用流式細胞測定研究異甘草素對中性粒細胞活化的影響。結(jié)果顯示LPS刺激能夠顯著增加中性粒細胞釋放活性氧，同時能促進中性粒細胞表面粘附分子CD11b的上調(diào)。異甘草素能夠呈劑量依賴性抑制中性粒細胞釋放活性氧，但是不能抑制CD11b的上調(diào)。見表7。

表7 異甘草素對LPS誘導(dǎo)中性粒細胞活化的影響

2.6 血人參中異甘草素對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞信號通路活化的調(diào)節(jié)作用

LPS刺激巨噬細胞0.5小時后，NF-κB通路中P65蛋白發(fā)生顯著的磷酸化修飾，MAPKs通路中P38、ERK1/2和JNK1/2也發(fā)生了顯著的磷酸化修飾。LPS刺激巨噬細胞3小時后，IRFs通路中IRF3以及STATs通路中的STAT1和STAT3也發(fā)生了顯著的磷酸化修飾。異甘草素能夠顯著抑制ERK1/2、JNK1/2和STAT1的磷酸化修飾，特別是對JNK1/2的磷酸化修飾具有很強的抑制作用。見圖1、圖2，表8、表9。

圖1 異甘草素對巨噬細胞信號通路活化的調(diào)節(jié)作用(0.5小時)

圖2 異甘草素對巨噬細胞信號通路活化的調(diào)節(jié)作用(3小時)

表8 異甘草素對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞信號通路活化的調(diào)節(jié)作用

表9 異甘草素對巨噬細胞信號通路活化的調(diào)節(jié)作用

3 討論

巨噬細胞和中性粒細胞是兩種重要的天然免疫細胞，具有很強的病原識別、吞噬和清除功能。在炎癥性疾病的發(fā)病過程中，巨噬細胞活化后，NF-κB和STAT1信號通路會被激活，進而導(dǎo)致NO合酶的增加，NO釋放量增加。NO不僅能夠殺傷侵入機體的微生物，同樣也會加重體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。同時，巨噬細胞分泌的炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β直接激活巨噬細胞和中性粒細胞，趨化因子MIP-1α和MCP-1趨化中性粒細胞至炎癥部位，加重體內(nèi)的炎癥反應(yīng)[6]。并且巨噬細胞分泌的IFN-β也能夠激活STAT1信號通路增強T細胞介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)，加重自身免疫性疾病的發(fā)展[7]。

中性粒細胞在炎癥性疾病發(fā)病過程中同樣發(fā)揮著重要作用[8]。在各種內(nèi)外源致炎因子刺激下，中性粒細胞表面使細胞停駐在免疫器官的粘附分子CD62L會被內(nèi)吞，同時使細胞進入炎癥部位的粘附分子CD11b會上調(diào)，從而促使中性粒細胞由免疫器官進入炎癥部位。炎癥部位的中性粒細胞內(nèi)NADPH氧化酶會被激活，合成大量超氧化物。超氧化物不僅會殺傷病原體，同時在炎癥性疾病中也會導(dǎo)致嚴重的組織損傷[9]。在病理條件下，體內(nèi)的活性氧產(chǎn)生和清除失衡，造成活性氧對機體的損傷。

血人參是貴州少數(shù)民族的特色苗藥，具有清熱解表、化痰、利濕、活血止痛之功效，在當(dāng)?shù)鼐哂袕V泛的使用價值。然而，現(xiàn)代藥理學(xué)對血人參的研究多集中在血人參提取物對肝損傷的體內(nèi)研究[10-11]，對于其在抗炎方面研究較少[12]，其發(fā)揮抗炎藥效的重要藥效物質(zhì)并不十分清楚。本研究在前期活性篩選時發(fā)現(xiàn)從血人參中提取分離的異甘草素具有顯著的抗炎活性[13-14]，這可能是其發(fā)揮藥效的關(guān)鍵物質(zhì)。因此本實驗采用LPS誘導(dǎo)巨噬細胞和中性粒細胞活化模型，對異甘草素的抗炎作用進行分析。研究發(fā)現(xiàn)異甘草素能夠抑制巨噬細胞釋放NO和炎癥因子的分泌，并且能夠抑制中性粒細胞釋放活性氧，這可能與異甘草素抑制JNK1/2、ERK1/2和STAT1的磷酸化有關(guān)。相對已有的研究，本研究通過體外實驗更明確地闡明了異甘草素的抗炎作用及機制，這可能是血人參發(fā)揮藥效的重要藥效物質(zhì)，但是對異甘草素發(fā)揮抗炎作用的藥物靶點仍不清楚，在后續(xù)的研究中還需在此方面做出進一步探索。