楊丹妮 陳幼楠 葛東宇 曲萌 賀萌 林小娟

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是一種涉及胃和十二指腸區(qū)域復(fù)雜癥狀的疾病，包括上腹痛或灼燒、餐后飽腹或早期飽腹[1]。因FD多為復(fù)合癥狀，難以針對(duì)性治療，從而影響患者的生活質(zhì)量。大約80%的消化不良患者沒(méi)有結(jié)構(gòu)性的病變，其生理病理機(jī)制尚不完全清楚，其中十二指腸運(yùn)動(dòng)障礙是主要的癥狀之一[2]。有研究發(fā)現(xiàn)[3]，十二指腸的輕度炎癥能引起局部感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)障礙,從而導(dǎo)致腹脹、腹痛。腹部推拿可以調(diào)節(jié)中焦氣機(jī)升降，促進(jìn)胃腸道的蠕動(dòng)。闌門(mén)穴是臟腑圖點(diǎn)穴法第一式的起始穴，具有調(diào)理小腸分清泌濁的功效[4]。建里屬任脈穴位，善于調(diào)理脾胃，具有消積化滯的功效，是治療胃腸相關(guān)疾病中中焦氣機(jī)不暢的常用穴[5]。闌門(mén)和建里都屬于中焦穴位，用推拿點(diǎn)穴的方法可以調(diào)節(jié)中焦氣機(jī)升降，對(duì)十二指腸動(dòng)力產(chǎn)生良性調(diào)節(jié)作用[6-7]。胃腸動(dòng)力的起搏和慢波的傳導(dǎo)根植于Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of cajal,ICC)，SCF/C-kit通路與ICC的增殖、發(fā)育、分化、表型維持等作用密切相關(guān)[8]。本文通過(guò)觀察小腸推進(jìn)率、十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，檢測(cè)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)、C-Kit原癌基因(C-Kit proto-oncogeneprotein，C-Kit)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)的表達(dá)，探究中焦點(diǎn)穴治療FD十二指腸動(dòng)力障礙的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只雄性健康SPF級(jí)SD大鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，6周齡，體質(zhì)量約180～200 g。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0006。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均于北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，相對(duì)濕度40%～50%,溫度(22±2) ℃，光照為12小時(shí)交替明暗，保持動(dòng)物房環(huán)境通風(fēng)整潔，及時(shí)更新食物及飲用水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審查批號(hào)：BUCM-4-2021032602-1058。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

枸櫞酸莫沙必利(MREDA公司，02008221)，ACK2阻斷劑(BIOLEGEND公司，135131)，SCF抗體(proteintech 公司，26582-1-AP)，C-kit抗體(Abcam ，ab256345)，GAPDH抗體(proteintech 公司，60004-1-lg)，IgG兔二抗(proteintech 公司，SA00001-2)，IgG鼠二抗(proteintech 公司 ，SA00001-1)，TNF-α、SCF、C-Kit ELISA試劑盒(RGB&CHN,RGB-60080R、RGB-60501R、RRGB-60500R)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

賽默飛多功能酶標(biāo)儀、賽默飛低溫高速離心機(jī)、賽默飛超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)，艾本德微量移液器(德國(guó)艾本德國(guó)際貿(mào)易有限公司)，CP124S電子天平(德國(guó)SARTORIUS AG公司)，DYY-6C型電泳儀(BIO-RAD Mini-TRANS-BLOT CELL)，TS-8搖床(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)，化學(xué)發(fā)光、熒光成像系統(tǒng)(BIO-RAD GelDoc XR+)。

1.4 動(dòng)物分組、造模及給藥

36只大鼠編號(hào)后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、模型阻斷組、西藥組、點(diǎn)穴組、點(diǎn)穴阻斷組，每組6只。采用輕度夾尾刺激法+不規(guī)則飲食法[7]對(duì)模型組、模型阻斷組、西藥組、點(diǎn)穴組、點(diǎn)穴阻斷組造模，建立FD模型。夾尾刺激時(shí)，將造模大鼠隨機(jī)分為5組，每6只一批放在同一桶內(nèi)，用長(zhǎng)海綿鉗夾大鼠尾巴遠(yuǎn)端，激怒大鼠，使其前肢離地，尋釁與其他大鼠撕打以激怒全籠的大鼠，刺激30分鐘/次，2次/天，兩次間隔大于6小時(shí)。夾尾刺激后按原序號(hào)放回所屬組內(nèi)。單日禁食，雙日投喂充足食物，飲水正常，造模共21天。模型阻斷組、點(diǎn)穴阻斷組從造模第5天起，以0.2 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)注射ACK2阻斷劑，隔日一次，持續(xù)到干預(yù)結(jié)束。

造模結(jié)束后，各組大鼠正常喂養(yǎng)1天，第2天點(diǎn)穴組與點(diǎn)穴阻斷組點(diǎn)撥闌門(mén)、建里穴(參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》《臟腑圖點(diǎn)穴法》)進(jìn)行干預(yù)，以大鼠的頭部為上，在闌門(mén)、建里穴施以左右方向的點(diǎn)撥，點(diǎn)穴層次以觸及腹主動(dòng)脈明顯搏動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn)。每穴點(diǎn)撥6分鐘，共12分鐘。西藥組給予莫沙必利藥液(以大鼠與人臨床用藥劑量、體型系數(shù)公式計(jì)算并稀釋成劑量為0.137 g/L水溶液)按照10 mL/kg灌胃，灌胃后抓取12分鐘。上述組干預(yù)大鼠的同時(shí)也對(duì)空白組、模型組大鼠進(jìn)行抓取12分鐘、同體積生理鹽水灌胃。6組大鼠在最后1次灌胃后禁食，24小時(shí)后進(jìn)行標(biāo)本采集。

1.5 標(biāo)本采集

測(cè)定當(dāng)天制備營(yíng)養(yǎng)性半固體糊，稱(chēng)體重后按照10 mL/kg灌服。30分鐘后麻醉斷頭處死大鼠，開(kāi)腹，結(jié)扎幽門(mén)并剪開(kāi)，迅速取出整段小腸，在測(cè)完小腸推進(jìn)率后，取距大鼠幽門(mén)2～4 cm的十二指腸組織，迅速放于凍存管中-80℃保存。取距大鼠幽門(mén)4～6 cm的十二指腸組織放于固定液中，48小時(shí)后將固定的標(biāo)本進(jìn)行包埋處理。

1.6 小腸推進(jìn)率計(jì)算

取出整段小腸后剝離腸系膜，將小腸鋪于白紙上，用軟尺測(cè)量幽門(mén)至回盲腸部全長(zhǎng)及幽門(mén)至半固體糊前沿的距離。計(jì)算公式：小腸推進(jìn)率=幽門(mén)至營(yíng)養(yǎng)半固體糊前沿的距離/幽門(mén)至回盲部全長(zhǎng)×100%。

1.7 十二指腸組織形態(tài)學(xué)觀察

使用石蠟切片機(jī)切片(4 μm)，室溫，切片盒保存; 使用二甲苯及各濃度乙醇進(jìn)行脫蠟，蘇木素染色，分化，伊紅染色，脫水，透明，封片。于生物顯微鏡下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，經(jīng)圖像采集系統(tǒng)收集圖片。

1.8 蛋白印記法(Weston blot,WB)檢測(cè)SCF、C-Kit、PI3K蛋白的表達(dá)

取凍存的組織約0.02 g，置于組織勻漿器中，離心后取得上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將樣品加入loading buffer與PBS混勻，95℃加熱5分鐘使蛋白變性，上樣。電泳設(shè)置80V 15分鐘，100V 80分鐘，電轉(zhuǎn)400V 27分鐘，室溫封閉，加入稀釋后的一抗，孵育4℃過(guò)夜。12小時(shí)后加入稀釋后的二抗孵育1小時(shí)，成像。采用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)十二指腸TNF-α、SCF、C-Kit的含量

取凍存的組織0.05 g，稱(chēng)重后置于組織勻漿器中，離心后取得上清液，按照ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè),與標(biāo)準(zhǔn)品比較計(jì)算TNF-α、SCF、C-Kit的含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況的觀察

造模期間，空白組的精神狀況良好，食量及飲水正常，毛色鮮亮有光澤，排便成型。造模各組精神萎靡，出現(xiàn)瞇眼、活動(dòng)次數(shù)減少的現(xiàn)象。毛色枯黃無(wú)光澤，造模各組體型明顯消瘦，食量減少。造模各組夾尾時(shí)易怒，常有與同伴廝打和跳出造模桶的現(xiàn)象,排便不成型，呈稀水樣便。

2.2 中焦點(diǎn)穴對(duì)小腸推進(jìn)率的影響

與空白組相比，模型組、模型阻斷組、西藥組小腸推進(jìn)率明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，點(diǎn)穴組、點(diǎn)穴阻斷組小腸推進(jìn)率明顯上升(P<0.05)；模型阻斷組與點(diǎn)穴阻斷組小腸推進(jìn)率有顯著差異(P<0.05)。如表1。

表1 各組FD大鼠小腸推進(jìn)率的比較

2.3 中焦點(diǎn)穴對(duì)十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

各組十二指腸無(wú)明顯器質(zhì)性改變，模型組十二指腸黏膜層可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層變薄；干預(yù)后點(diǎn)穴組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有明顯減少，肌層有恢復(fù)的趨勢(shì)。如圖1。

注: A 空白組;B 模型組;C 模型阻斷組;D 西藥組;E 點(diǎn)穴組;

2.4 ELISA法檢測(cè)十二指腸組織中TNF-α、SCF、C-Kit表達(dá)的水平

與空白組相比，模型組、模型阻斷組、點(diǎn)穴阻斷組SCF、C-Kit表達(dá)顯著降低、TNF-α表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，西藥組、點(diǎn)穴組SCF、C-Kit表達(dá)顯著升高、TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與點(diǎn)穴組相比，點(diǎn)穴阻斷組SCF、C-Kit表達(dá)顯著降低、TNF-α表達(dá)顯著升高(P<0.05)。如表2。

表2 各組FD大鼠十二指腸組織TNF-α、SCF、C-Kit含量的比較

2.5 Weston blot法檢測(cè)十二指腸組織中SCF、C-kit、PI3K蛋白表達(dá)的水平

與空白組相比，模型組、模型阻斷組、點(diǎn)穴阻斷組蛋白的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，西藥組的C-Kit、PI3K的表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，西藥組、點(diǎn)穴組蛋白的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與點(diǎn)穴組相比，點(diǎn)穴阻斷組SCF、PI3K的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，C-Kit的表達(dá)有下降的趨勢(shì)但無(wú)顯著差異(P>0.05)；西藥組與點(diǎn)穴組相比PI3K的表達(dá)有顯著差異(P<0.05)。如圖2、表3。

注: A 空白組;B 模型組;C 模型阻斷組;D 西藥組;E 點(diǎn)穴組;F 點(diǎn)穴阻斷組

表3 各組FD大鼠十二指腸組織SCF、C-kit、PI3K蛋白表達(dá)的比較

4 討論

現(xiàn)代研究中對(duì)功能性消化不良病理生理學(xué)的最新認(rèn)識(shí)是將十二指腸作為致病中心，認(rèn)為上腹痛或灼燒、餐后飽腹或早期飽腹多與十二指腸密切相關(guān)[9-11]。Miwa H等[11]人認(rèn)為，F(xiàn)D的相關(guān)病理因素如胃酸分泌、幽門(mén)螺旋桿菌感染、微生物群、胃腸激素等都是通過(guò)刺激十二指腸而產(chǎn)生的。當(dāng)十二指腸黏膜通透性增加時(shí)，會(huì)促使腸腔中的脂肪酸、膽汁酸、微生物等多種刺激物透過(guò)黏膜層，形成十二指腸低度炎癥。Samsom等人[12]發(fā)現(xiàn)，給FD患者和健康人對(duì)照組的十二指腸注入酸時(shí)，與對(duì)照組相比，F(xiàn)D患者會(huì)產(chǎn)生十二指腸運(yùn)動(dòng)障礙。還有研究顯示[13]，F(xiàn)D常伴隨十二指腸無(wú)力性收縮導(dǎo)致十二指腸運(yùn)動(dòng)障礙的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上研究結(jié)論相一致，HE結(jié)果顯示模型組、模型阻斷組十二指腸黏膜層可出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肌層變薄的現(xiàn)象，提示本實(shí)驗(yàn)中FD模型可能存在十二指腸低度炎癥。干預(yù)后點(diǎn)穴組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有明顯減少，肌層有恢復(fù)的趨勢(shì)。模型組小腸推進(jìn)率與空白組相比顯著降低，而在使用C-Kit阻斷劑ACK2之后，模型阻斷組的小腸推進(jìn)率進(jìn)一步降低，經(jīng)過(guò)中焦點(diǎn)穴治療后，小腸推進(jìn)率明顯上升，與空白組無(wú)明顯差異，進(jìn)一步提示本實(shí)驗(yàn)中FD伴隨著十二指腸低度炎癥和十二指腸動(dòng)力障礙，中焦點(diǎn)穴可以緩解十二指腸低度炎癥，并通過(guò)SCF/C-Kit通路恢復(fù)十二指腸動(dòng)力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中點(diǎn)穴阻斷組的小腸推進(jìn)率與空白組、點(diǎn)穴組無(wú)顯著性差異可能是因?yàn)橹薪裹c(diǎn)穴可能通過(guò)機(jī)械刺激改變腹部壓力，從而加速食物通過(guò)胃腸道[14]；中焦點(diǎn)穴通過(guò)調(diào)節(jié)交感神經(jīng)與副交感神經(jīng)促進(jìn)十二指腸的運(yùn)動(dòng)。副交感神經(jīng)起于第四腦室底部的迷走神經(jīng)背核處，是迷走神經(jīng)的主要成分，與交感神經(jīng)在腹部共同負(fù)責(zé)內(nèi)臟的運(yùn)動(dòng)[15]。Ting SJ等[16]發(fā)現(xiàn)，在十二指腸肌間神經(jīng)叢中存在大量的交感神經(jīng)與迷走神經(jīng)軸突。研究顯示，F(xiàn)D患者存在副交感神經(jīng)張力的降低[17-18]，在腹部進(jìn)行推拿可以調(diào)節(jié)交感神經(jīng)與副交感神經(jīng)的活動(dòng)，從而促進(jìn)胃腸的蠕動(dòng)[19]。

十二指腸的運(yùn)動(dòng)由腸壁內(nèi)層的環(huán)行肌和外層縱行肌的舒縮運(yùn)動(dòng)共同完成，其運(yùn)動(dòng)形式分為三種：緊張性收縮、分節(jié)運(yùn)動(dòng)及蠕動(dòng)。蠕動(dòng)將分節(jié)運(yùn)動(dòng)后的腸內(nèi)容物向前推進(jìn)一步,到新的腸段再開(kāi)始新的分節(jié)運(yùn)動(dòng)。慢波對(duì)于蠕動(dòng)和分節(jié)運(yùn)動(dòng)的產(chǎn)生非常重要[20]。ICC是腸運(yùn)動(dòng)基本單位中重要的協(xié)調(diào)者[21]在十二指腸中主要存在兩種ICC亞型，肌間ICC位于十二指腸環(huán)形肌與縱形肌之間，是慢波的起搏細(xì)胞；深肌神經(jīng)叢位于十二指腸環(huán)形肌深部腸肌神經(jīng)叢中，它們僅在小腸中發(fā)現(xiàn)，有介導(dǎo)腸道神經(jīng)遞質(zhì)的作用[22]。酪氨酸激酶受體(C-Kit)是ICCs的特異性標(biāo)志物，C-Kit的丟失會(huì)引起十二指腸動(dòng)力障礙，SCF是C-Kit的天然配體，二者特異性結(jié)合后SCF/c-Kit通路可以調(diào)控ICCs的增殖、發(fā)育、分化與表型維持[23-25]。

胃腸道炎癥因子TNF-α的表達(dá)上調(diào)被認(rèn)為在FD的發(fā)病機(jī)制中起到了關(guān)鍵性的作用[26]。促炎性M1巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α可以激活核因子κB通路抑制SCF的表達(dá)，通過(guò)降低ICCs細(xì)胞活力、增加細(xì)胞凋亡來(lái)誘導(dǎo)ICC的炎癥性損傷[27]。 在 ICC 中，TNF-α還會(huì)降低 C-Kit表達(dá)并抑制 ICC 中的起搏電流、破壞ICC的表型并使ICC數(shù)量減少，從而使腸道蠕動(dòng)異常[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組、模型阻斷組、點(diǎn)穴阻斷組SCF、C-Kit表達(dá)與空白組相比顯著降低、TNF-α表達(dá)顯著升高；與模型組相比，西藥組、點(diǎn)穴組干預(yù)后SCF、C-Kit表達(dá)顯著升高、TNF-α表達(dá)顯著降低；與點(diǎn)穴組相比，點(diǎn)穴阻斷組SCF、C-Kit表達(dá)顯著降低、TNF-α表達(dá)顯著升高，TNF-α與SCF、C-Kit的含量呈負(fù)相關(guān)，提示中焦點(diǎn)穴可以抑制FD大鼠十二指腸TNF-α的生成，進(jìn)而恢復(fù)SCF、C-Kit的表達(dá)，從而影響ICC的增殖、發(fā)育、分化與表型維持。

PI3K是一種由p85、p110兩種亞基組成的二聚體蛋白質(zhì)[29]。PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85 可經(jīng)由SCF誘發(fā)，與C-Kit 的Tyr721、Tyr730相關(guān)位點(diǎn)結(jié)合，激活PI3K/Akt通路，磷酸化后的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)可使凋亡因子Bad蛋白構(gòu)象發(fā)生改變從而使其失活，還可使凋亡因子Bax形成同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡[30]，從而使PI3K/Akt通路發(fā)揮抗凋亡作用，維持ICC細(xì)胞增殖的狀態(tài)[31]。有研究表明[32]，PI3K的抑制劑LY 294002可在2～4天內(nèi)抑制慢波的發(fā)展并阻止節(jié)律，出現(xiàn)慢波的振幅和頻率隨時(shí)間的減少，慢波消失的同時(shí)出現(xiàn)了腸內(nèi)肌間ICC細(xì)胞消失。由此可知PI3K是肌間ICC增殖的關(guān)鍵下游信號(hào)，PI3K表達(dá)的減少會(huì)引起慢波消失與活動(dòng)減弱，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組、模型阻斷組、點(diǎn)穴阻斷組SCF、C-Kit、PI3K蛋白的表達(dá)與空白組相比顯著降低，西藥組、點(diǎn)穴組蛋白的表達(dá)與模型組相比顯著升高；與點(diǎn)穴組相比，點(diǎn)穴阻斷組SCF、PI3K的表達(dá)顯著降低，C-Kit的表達(dá)有下降的趨勢(shì)但無(wú)顯著差異。提示中焦點(diǎn)穴可能通過(guò)上調(diào)SCF/C-Kit通路，加強(qiáng)了ICC增殖信號(hào)PI3K的表達(dá)。

綜上所述，中焦點(diǎn)穴可以抑制FD大鼠十二指腸TNF-α的生成，緩解十二指腸炎癥，進(jìn)而調(diào)節(jié)SCF/C-kit通路激活Cajal間質(zhì)細(xì)胞增殖的相關(guān)信號(hào)，從而恢復(fù)十二指腸動(dòng)力。