楊金玲

(臨沂市中醫(yī)醫(yī)院，山東 臨沂 276002)

杞蓉膠囊由杞蓉片改劑型而來，由枸杞子、肉蓯蓉、鎖陽、蛇床子、女貞子、五味子、金櫻子、淫羊藿、菟絲子九味藥組成，有補(bǔ)腎固精，益智安神的功效，用于腎虧遺精、陽萎早泄、失眠健忘等癥狀。杞蓉片原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為部頒標(biāo)準(zhǔn)[1]，僅包括性狀項(xiàng)、理化鑒別項(xiàng)、淫羊藿的薄層鑒別和檢查項(xiàng)，未收載含量測定項(xiàng)，不能很好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。毛蕊花糖苷在臨床上對(duì)治療帕金森病有效，其機(jī)制可能與黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中酪氨酸羥化酶的表達(dá)、改善海馬突觸可塑性、促進(jìn)海馬神經(jīng)生長因子及減輕氧化應(yīng)激有關(guān)[2-3]。本研究建立了杞蓉膠囊中源自藥材肉蓯蓉成分-毛蕊花糖苷的含量測定方法，該法簡單、靈敏度高、分離度好。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀(美國waters公司)；Kromasil C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；Agilent 8453紫外可見分光光度計(jì)(安捷倫公司)；SB-4200 DTD型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.2試藥 杞蓉膠囊(自制，規(guī)格：0.32 g/粒；批號(hào)：20150401、20150402、20150403)；毛蕊花糖苷對(duì)照品購自中國食品藥品檢定院，批號(hào)：111530-201411(供含量測定用)，乙腈、甲醇為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱Kromasil C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-1%醋酸溶液(12∶13∶75)；流速1.0 mL/min；柱溫：室溫。檢測波長334 nm；進(jìn)樣量20 μL。理論板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計(jì)算不得低于3000。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備 精密稱取毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成含毛蕊花糖苷0.0812 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加流動(dòng)相制成含毛蕊花糖苷0.0203 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取杞蓉膠囊內(nèi)容物約2.5 g，精密稱定，移入錐形瓶中(具塞)，精密加入1%醋酸50%甲醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱定重量，用上述同樣溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性對(duì)照溶液 按杞蓉膠囊處方比例稱取缺肉蓯蓉的其他藥味，按照杞蓉膠囊制備工藝制備陰性樣品，并按2.2.2項(xiàng)下方法操作，制備陰性對(duì)照溶液。

2.3專屬性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，結(jié)果：供試品中毛蕊花糖苷與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，與相鄰峰分離度大于1.5，陰性對(duì)照溶液未見該峰，表明杞蓉膠囊中其他成分對(duì)毛蕊花糖苷的測定無干擾。結(jié)果見圖1。

A毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液 B供試品溶液 C陰性對(duì)照溶液；a毛蕊花糖苷圖1 毛蕊花糖苷HPLC圖

2.4線性關(guān)系考察 分別精密量取毛蕊花糖苷濃度為0.0812 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，置于10 mL量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得系列毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液。取上述系列對(duì)照品溶液各取20 μL依次注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X，μg)橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得毛蕊花糖苷回歸方程為：Y=4.58+1608.23X，相關(guān)系數(shù)r=0.9994，n=6。

結(jié)果表明，毛蕊花糖苷進(jìn)樣量在0.2436-0.6496 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn) 吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積，結(jié)果RSD為0.35%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6份杞蓉膠囊內(nèi)容物粉末，各2.5 g，按2.2.2項(xiàng)下方法，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄其峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果RSD為1.12%，表明方法重復(fù)性較好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣1次，每次20 μL，記錄其峰面積，以峰面積計(jì)算，結(jié)果RSD為0.94%，表明杞蓉膠囊供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收率試驗(yàn) 取毛蕊花糖苷含量為0.1675 mg/g的杞蓉膠囊(批號(hào)：20150401)6份，分別精密稱定，精密加入毛蕊花糖苷對(duì)照品0.2110 mg，按2.2.2項(xiàng)下方法制備制成6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。結(jié)果表明本法具有良好的加樣回收率。

表1 杞蓉膠囊加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9樣品含量測定 取3批樣品(批號(hào)：20150401、20150402、20150403)，制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 杞蓉膠囊中毛蕊花糖苷的含量

3 討論

3.1流動(dòng)相選擇 有研究曾用乙腈-甲醇-1%醋酸溶液(8∶13∶79)、乙腈-甲醇-1%醋酸溶液(10∶15∶75)、乙腈-1%冰醋酸溶液(20∶80)等作為流動(dòng)相[4-6]。經(jīng)試驗(yàn)，以本文所用流動(dòng)相分離效果較好。

3.2提取溶劑選擇 分別采用1%醋酸甲醇溶液、1%醋酸50%甲醇、流動(dòng)相進(jìn)行提取，結(jié)果表明，以1%醋酸甲醇溶液提取的樣品毛蕊花糖苷峰峰形前延，而用1%醋酸50%甲醇和流動(dòng)相提取的樣品峰形較好，提取率高，且無明顯差異，但用流動(dòng)相提取時(shí)濾過較困難，故選擇1%醋酸50%甲醇為含量測定用提取溶劑。

3.3不同提取方式考察 以1%醋酸50%甲醇為提取溶劑分別采用超聲波和加熱回流兩種提取方式，結(jié)果表明：超聲波提取與加熱回流提取無明顯差異，為簡化試驗(yàn)操作，故選擇提取方式為超聲提取40 min。

3.4提取時(shí)間考察 分別超聲提取20、40、60 min測定樣品含量，結(jié)果表明：超聲提取40 min與60 min比較幾乎無明顯差異，為節(jié)約時(shí)間，提高效率，故選擇超聲提取40 min較好。