江亞惠，楊生璽，拉青才讓，2，易 云，米云晟，趙延禮*

(1.青海大學(xué)，青海 西寧 810001；2.青海省海南藏族自治州藏醫(yī)院，青海 海南 813000；3.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院，山西 長(zhǎng)治 046099)

藏藥德孜陽(yáng)新(DZYX)用于抗腫瘤效果明顯，但作用機(jī)制不明。本研究通過(guò)探討DZYX醇提物對(duì)人胃癌AGS細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的影響，初步明確可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS購(gòu)自武漢普諾賽公司。AGS細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中(37℃，5% CO2)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要藥物與試劑

藏藥DZYX為青海省海南州藏醫(yī)院產(chǎn)品；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品；CCK-8試劑盒為上海翊圣生物科技有限公司產(chǎn)品(批號(hào)C6102030)；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為北京四正柏生物科技有限公司產(chǎn)品(批號(hào)20210705)；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒為廣州銳博生物科技有限公司產(chǎn)品；β-actin、Cyclin A、CDK2、p-mTOR、AKT、P-AKT為美國(guó)Cell Signaling Technology 公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器

Spectra Max Paradigm型多功能酶標(biāo)儀為美國(guó)Molecular Devices公司產(chǎn)品；NovoCyte型流式細(xì)胞儀為美國(guó)艾森公司產(chǎn)品；xCELLigence RTCA DP型實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀為美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；PowerPac Universal型電泳儀、Mini PROTEAN Tetra Cell型電泳槽為美國(guó) Bio-Rad公司產(chǎn)品；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海愛(ài)朗儀器有限公司產(chǎn)品；Ti2-E型熒光顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DZYX醇提物的提取與配制

研磨DZYX丸劑，稱取60 g DZYX粉末浸泡于95%乙醇中過(guò)夜，回流提取1 h，后濃縮，殘余物經(jīng)真空冷凍干燥得19.44 g粗提物。用DMSO溶解藏藥DZYX醇粗提物并經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后配制成600 mg/mL的母液，儲(chǔ)存(-20 ℃)備用。

1.2.2 細(xì)胞分組

設(shè)置對(duì)照組(含1‰二甲基亞砜)、DZYX組(含200、400、600μg/mL DZYX醇提物)、順鉑組(10μg/mL DDP)。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察

將AGS細(xì)胞接種于6孔板中(3.5×103/每孔)，待細(xì)胞貼壁后，按照相應(yīng)濃度加藥，處理AGS細(xì)胞(24h，48h)，觀察AGS細(xì)胞數(shù)量變化并拍照記錄。

1.2.4 細(xì)胞活性檢測(cè)

將AGS細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組加藥，分別培養(yǎng)24、48 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育(37℃)1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞活力=[OD(加藥組)-OD(空白組)]/[OD(溶劑對(duì)照組)-OD(空白組)]×100%

1.2.5 RTCA實(shí)時(shí)增殖曲線檢測(cè)

消化收集對(duì)數(shù)期AGS細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，在超凈臺(tái)內(nèi)靜置30 min，放入RTCA Station，次日取出E-Plate 16板，更換含藥培養(yǎng)基，監(jiān)測(cè)胃癌細(xì)胞的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)增殖曲線。

1.2.6 EdU增殖水平檢測(cè)

將AGS細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的DZYX醇提物，培養(yǎng)(37℃)24 h，根據(jù)EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)AGS細(xì)胞進(jìn)行EdU標(biāo)記，細(xì)胞固化，Apollo染色及Hochest 333342染色后，在熒光顯微鏡下觀察拍照并計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)=[EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(綠色)/細(xì)胞總數(shù)(藍(lán)色)]×100%。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合PI單染檢測(cè)

消化收集AGS細(xì)胞，離心(450×g)5 min，用預(yù)冷PBS洗滌1次，加入預(yù)冷的70%乙醇固定過(guò)夜(4℃)。次日，離心(450×g)5 min，去除70%乙醇，用預(yù)冷PBS洗滌，每管加入1 μL RNase A和5 μL PI混勻(低速渦旋)，避光孵育15 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 Western blot檢測(cè)

消化收集AGS細(xì)胞，使用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白樣品在12%的SDS-PAGE電泳體系中分離后，轉(zhuǎn)到0.22 μm PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入β-actin、p-mTOR、p-AKT、AKT、Cyclin A、CDK2等抗體于室溫孵育1 h，過(guò)夜(4℃)，用TBST洗膜3次，加入二抗于室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min，將ECL化學(xué)發(fā)光液均勻鋪到膜上置于化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AGS細(xì)胞數(shù)量變化

倒置顯微鏡觀察顯示，與對(duì)照組比較，給予不同濃度DZYX醇提物作用后，AGS細(xì)胞數(shù)量均減少，具有濃度依賴性，且600 μg/mL組抑制增殖效果與順鉑組抑制效果接近。(圖1)

圖1 DZYX醇提物對(duì)AGS細(xì)胞數(shù)量的影響圖(100×)

2.2 AGS細(xì)胞活性變化

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，隨著DZYX醇提物濃度增加，各加藥組的吸光度值明顯下降，AGS細(xì)胞活力顯著下降(P<0.01)，且呈濃度依賴性，提示DZYX醇提物對(duì)AGS細(xì)胞的增殖具有抑制作用。(表1)

表1 DZYX醇提物對(duì)AGS細(xì)胞活性影響結(jié)果Table 1 Effects of DZYX ethanol extract on the activity of AGS

2.3 AGS細(xì)胞實(shí)時(shí)增殖曲線變化

經(jīng)不同濃度DZYX醇提物作用后，AGS細(xì)胞增殖數(shù)量均低于對(duì)照組(P<0.01)，且細(xì)胞增殖速度顯著下降，隨藥物濃度增加，DZYX醇提物抑制AGS細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)，提示DZYX醇提物對(duì)AGS細(xì)胞增殖具有抑制作用，且呈濃度依賴性。(圖2，表2)

圖2 AGS細(xì)胞實(shí)時(shí)增殖變化圖

表2 RTCA實(shí)時(shí)增殖曲線定量分析結(jié)果Table 2 Quantitative analysis of RTCA real-time proliferation

2.4 AGS細(xì)胞增殖水平變化

為進(jìn)一步研究DZYX醇提物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，采用EdU摻入法檢測(cè)DZYX醇提物作用下AGS細(xì)胞增殖水平，與對(duì)照組比較，DZYX醇提物作用下的AGS細(xì)胞中的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且具有濃度依賴性，提示DZYX醇提物能夠抑制AGS細(xì)胞的增殖。(圖3)

圖3 EdU染色檢測(cè)各組增殖情況(EdU染色，100×)

表3 EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

2.5 AGS細(xì)胞周期變化及周期蛋白Cyclin A、CDK2含量變化

與對(duì)照組比較，不同濃度DZYX醇提物作用胃癌AGS細(xì)胞24 h后，S期細(xì)胞所占比例顯著增高，G2/M期細(xì)胞比例減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖4，表4)Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，給予AGS細(xì)胞600 μg/mL DZYX醇提物(不同時(shí)間)，可明顯下調(diào)AGS細(xì)胞中與S期相關(guān)的蛋白Cyclin A、CDK2的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在藥物作用12 h內(nèi)，Cyclin A、CDK2的抑制效果顯著，可能與兩種蛋白在AGS細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)間有關(guān)。提示DZYX醇提物可將AGS細(xì)胞阻滯在S期。(圖5，表5)

圖4 DZYX醇提物對(duì)AGS細(xì)胞周期的影響圖

表4 S期細(xì)胞所占比例

圖5 DZYX對(duì)AGS細(xì)胞Cyclin A、CDK2蛋白表達(dá)的影響圖

表5 Cyclin A和CDK2蛋白含量變化值Table 5 Variations of protein content of Cyclin A and

2.6 PI3K/AKT/mTOR通路蛋白p-mTOR、AKT、p-AKT含量變化

與對(duì)照組比較，在DZYX醇提物作用下，與增殖相關(guān)信號(hào)通路PI3K/AKT/mTOR相關(guān)蛋白p-mTOR的表達(dá)水平降低，p-AKT的表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖6，表6)

圖6 DZYX醇提物對(duì)PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的影響圖

表6 p-AKT和p-mTOR蛋白含量變化值Table 6 Variations of protein content of p-AKT and

3 討論

本研究顯示，德孜陽(yáng)新醇提物能抑制AGS細(xì)胞的增殖并影響細(xì)胞周期的分布，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活有關(guān)。

DZYX由多種藥物組成，研究證明由多味藥材配伍而成的方劑作用靶點(diǎn)多，故作用機(jī)制難以闡明。金福安湯可通過(guò)誘導(dǎo)Kaiso上調(diào)抑制肺癌細(xì)胞H1650增殖和轉(zhuǎn)移[1]；解毒三根湯與PD-L1抑制劑聯(lián)用能明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[2]；李明等發(fā)現(xiàn)黃連湯可下調(diào)CCNB1表達(dá)水平來(lái)抑制肝癌HCC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖[3]；會(huì)厭逐瘀湯作用于喉癌LSCC細(xì)胞，可將細(xì)胞阻滯于G0/G1期并誘導(dǎo)其凋亡從而抑制喉癌的發(fā)展，具有抗腫瘤作用[4]。本研究通過(guò)采用CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU摻入實(shí)驗(yàn)和RTCA細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)觀察DZYX醇提物對(duì)胃癌AGS細(xì)胞活性和增殖的影響，三種實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)不同濃度DZYX醇提物作用胃癌細(xì)胞，能抑制AGS細(xì)胞的增殖，且具有濃度依賴性，提示藏藥DZYX能夠抑制AGS細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞周期紊亂是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因[5]。細(xì)胞周期可分為G1(DNA合成前期)、S(DNA合成期)、G2(DNA合成后期)、M(有絲分裂期)，并在細(xì)胞周期蛋白(cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinases in-hibitors，CKIs)、周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)等多種蛋白共同調(diào)控下驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期循環(huán)[6，7]。其中任何一個(gè)階段出現(xiàn)問(wèn)題都可能導(dǎo)致細(xì)胞周期停止，因此阻滯細(xì)胞周期的關(guān)鍵部分可有效控制細(xì)胞增殖，具有潛在的抗癌作用。S期進(jìn)行DNA的合成，Cyclin A與CDK2是調(diào)控S期的兩個(gè)關(guān)鍵因子[8]，細(xì)胞進(jìn)入S期后激活CDK2和Cyclin A，二者結(jié)合形成Cyclin-CDK激酶復(fù)合物推動(dòng)S期進(jìn)程。細(xì)胞通過(guò)上調(diào)兩種調(diào)控因子的表達(dá)來(lái)維持DNA合成，如果無(wú)法合成足夠的Cyclin-CDK激酶復(fù)合物，就能阻礙DNA復(fù)制，將細(xì)胞阻滯于S期。本次研究發(fā)現(xiàn)，DZYX醇提物處理胃癌AGS細(xì)胞的結(jié)果顯示，與Control組比較，不同濃度的加藥組S期所占比例顯著增加。同時(shí)Western blot結(jié)果證實(shí)，AGS細(xì)胞經(jīng)藥物作用后細(xì)胞周期蛋白Cyclin A、CDK2表達(dá)水平降低，Cyclin A、CDK2在細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)間較早，12 h內(nèi)藥物對(duì)兩種蛋白表達(dá)抑制效果極其明顯，表明DZYX醇提物可能通過(guò)下調(diào)Cyclin A、CDK2蛋白表達(dá)，降低Cyclin-CDK激酶復(fù)合物合成，導(dǎo)致AGS細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行DNA復(fù)制，阻滯AGS細(xì)胞于S期。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖重要信號(hào)通路，研究發(fā)現(xiàn)多種癌癥中存在該通路的異常激活，有效抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵分子，對(duì)控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。AKT又稱為白激酶B(PKB)，包括AKT1、AKT2和AKT3三種亞型，是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子[9]。AKT的過(guò)度激活是惡性腫瘤的常見(jiàn)分子特征[10，11]，活化后的AKT通過(guò)對(duì)多種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，參與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及葡萄糖代謝等多種生理活動(dòng)[12]。研究發(fā)現(xiàn)在肝癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中均觀察到AKT的激活與過(guò)表達(dá)[13-15]，因此抑制AKT磷酸化是治療惡性腫瘤的一個(gè)有效靶點(diǎn)。mTOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素)是位于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路下游的靶蛋白，可由AKT激活[16]，在細(xì)胞生長(zhǎng)代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、蛋白翻譯及自噬多種生物過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17]。檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中p-AKT與p-mTOR的蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，DZYX醇提物可降低胃癌細(xì)胞中p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明DZYX醇提物可抑制AKT和mTOR的磷酸化，由此提示DZYX醇提物可能通過(guò)阻斷PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，DZYX醇提物可抑制AGS細(xì)胞增殖并影響細(xì)胞周期的分布，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活有關(guān)。