尹啟超，耿 惠，馬 婕，王生艷，郭 勇，崔 森#

(1.青海大學(xué)研究生院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001)

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)患者血小板水平偏低；又有報(bào)道稱，隨著海拔高度的增加和進(jìn)駐高原時(shí)間的延長，血小板計(jì)數(shù)顯著增加[1]。本研究擬通過監(jiān)測(cè)藏族男性中年CMS患者外周血血小板數(shù)量及相關(guān)指標(biāo)變化，進(jìn)一步研究藏族男性中年CMS患者與藏族健康人群之間骨髓巨核細(xì)胞(megakaryocytes，MEG)增殖、凋亡變化及相關(guān)蛋白表達(dá)情況的差異。

1 材料與方法

1.1 主要試劑儀器

Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD公司，美國)、BD IntraSure Kit試劑盒(BD公司，美國)；APC anti-human CD61、Brilliant Violet 421 anti-human CD41、FITC Anti-Bcl-2、PE Rabbit Anti- Active caspase-3、PE Anti-human CD110(C-MPL)、FITC Anti-bax(Biolegend公司，美國)；細(xì)胞周期試劑盒(聯(lián)科生物公司，中國)。全血細(xì)胞分析儀(邁瑞公司，中國)；流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)。

1.2 研究方法

1.2.1 研究對(duì)象及分組

研究對(duì)象：2021年1月至12月在青海省玉樹市八一醫(yī)院就診的CMS患者及健康體檢者近百例，按研究意圖剔除影響本研究結(jié)果的干擾性病例，各組余8例，均為長期居住在海拔高于3000 m地區(qū)的藏族男性，兩組間年齡(46.63±15.02 vs 49.63±16.27)和BMI(24.75±3.73 vs 25.11±1.93)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。CMS患者以第六屆國際高原醫(yī)學(xué)和低氧生理學(xué)術(shù)大會(huì)(中國西寧，2004)推薦的CMS診斷標(biāo)準(zhǔn)確診[2]。

分組：CMS患者8例，納入CMS組；健康體檢者8例，納入CON組。

本研究獲得青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可。

1.2.2 主要分析指標(biāo)選擇

外周血血小板計(jì)數(shù)(platelet，PLT)、血小板壓積(plateletcrit，PCT)、平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)、血小板分布寬度(platelet distribution width，PDW)、大血小板比例(platelet-large cell ratio，P-LCR)；MEG增殖率、凋亡率、C-MPL、Bax、Bcl-2、caspase-3。

1.2.3 標(biāo)本采集

于早上8：00從肘靜脈采集靜脈血2 mL行外周血細(xì)胞學(xué)分析。選擇髂后上棘為穿刺點(diǎn)，行骨髓穿刺術(shù)抽取骨髓液0.1～0.2 mL置玻片上，迅速制作涂片5～6張，以備細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，然后再抽吸骨髓液5～10 mL，裝入含EDTA的真空采血管中用于流式檢測(cè)。

1.2.4 骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的MEG檢測(cè)

流式管中加入100 μL抗凝骨髓、1 mL PBS，混勻后于室溫孵育5 min，離心(300g，5min)，棄上清，充分洗滌樣本，重復(fù)2次。加入2 mL Lysing solution，靜置10 min后離心(300g，5min)棄上清，加入2 mL PBS混勻、重懸、沉淀，離心(300g，5min)棄上清。每管加入BV421-CD41、APC-CD61抗體各5 μL，混勻后避光孵育20 min。細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后加入500 μL PBS重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)、計(jì)算骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)的CD41+、CD61+細(xì)胞比率。

1.2.5 巨核細(xì)胞增殖率檢測(cè)

按照1.2.4所示方法孵育抗凝骨髓。加入Lysing solution去除紅細(xì)胞，用BV421-CD41、APC-CD61染色處理。在清洗處理后的抗凝骨髓中加入1 mL DNA染色液和10 μL免疫染色通透液，振蕩(渦旋，5～10s)混勻，在室溫、避光條件下孵育30 min后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各時(shí)相MEG比例。

1.2.6 巨核細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

按照1.2.4所示方法孵育抗凝骨髓。加入Lysing solution去除紅細(xì)胞，用BV421-CD41、APC-CD61染色處理。在清洗處理后的抗凝骨髓中加入200 μL Binding Buffer重懸、沉淀，加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，混勻，在室溫、避光條件下孵育15 min，加入200 μL Binding Buffer，混勻后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MEG凋亡率。

1.2.7 巨核細(xì)胞TPO配體C-MPL表達(dá)水平檢測(cè)

按照1.2.4所示方法孵育抗凝骨髓。加入Lysing solution去除紅細(xì)胞，用BV421-CD41、APC-CD61染色處理。在清洗處理后的抗凝骨髓中加入5 μL PE-CD110(C-MPL)，混勻，在室溫、避光條件下孵育20 min。經(jīng)PBS洗滌后使用500 μL PBS重懸細(xì)胞，混勻后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨核細(xì)胞C-MPL表達(dá)水平。

1.2.8 巨核細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3表達(dá)水平檢測(cè)

抗凝骨髓按照1.2.4所示方法孵育。加入Lysing solution去除紅細(xì)胞，用BV421-CD41、APC-CD61染色處理。在清洗處理后的抗凝骨髓中加入100 μL試劑A(BD IntraSure Kit)，混勻，在室溫避光條件下孵育5 min，加入2 mL Lysing solution，靜置10 min后離心棄上清，加入50 μL試劑B(BD IntraSure Kit)充分混勻，然后分別加入FITC Anti-Bax、PE Rabbit Anti-Active Caspase-3、FITC Anti-Bcl-2抗體各5 μL，混勻，避光孵育20 min。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后使用500 μL PBS重懸，混勻后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨核細(xì)胞Bax、Bcl-2、caspase-3表達(dá)水平。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CMS患者外周血小板參數(shù)

外周血細(xì)胞學(xué)分析顯示，CMS組外周血PLT[(180.38±46.01)×109/L]低于CON組[(249.63±51.39)×109/L](P<0.001)，PCT[(0.17±0.03)%]低于CON組[(0.22±0.03)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)，P-LCR[(23.83±5.18)%]，高于CON組[(17.89±10.34)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)，而MPV、PDW兩組間接近臨界值(P=0.054，P=0.072)。(表1)

表1 CMS組和CON組外周血細(xì)胞學(xué)參數(shù)Table 1 Peripheral hematological parameter of CMS group and CON

2.2 CMS患者骨髓MEG增殖率及凋亡率

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，CMS組MEG增殖率高于CON組(P=0.001)(圖1)，凋亡率低于CON組(P=0.002)(圖2)；而BMMNCs中的MEG比例在CMS組呈增高趨勢(shì)，但兩組間無顯著性差異(P=0.585)(表2，圖 3)。

圖1 骨髓巨核細(xì)胞增殖率(%)

圖2 骨髓巨核細(xì)胞凋亡率(%)

表2 CMS組和CON組骨髓MEG比例及增殖率和凋亡率Table 2 Proportion of MEG，proliferation rate and apoptosis rate in CMS group and CON

圖3 BMMNCs中巨核細(xì)胞比例(%)

2.3 骨髓巨核細(xì)胞C-MPL及凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2、caspase-3表達(dá)水平

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，CMS組骨髓MEG的C-MPL、Bax、Bcl-2及caspase-3表達(dá)水平在兩組間均未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(均P>0.05)。(表3，圖 4～7)

表3 CMS組和CON組骨髓巨核細(xì)胞C-MPL及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平Table 3 Expression levels of C-MPL and apoptosis-related proteins in MEG of CMS group and CON

圖4 骨髓巨核細(xì)胞C-MPL表達(dá)水平(%)

圖5 骨髓巨核細(xì)胞Bax表達(dá)水平(%)

圖6 骨髓巨核細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平(%)

圖7 骨髓巨核細(xì)胞caspase-3表達(dá)水平(%)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，藏族男性中年CMS患者外周血小板計(jì)數(shù)較藏族健康者減少，PCT降低，P-LCR升高，與羅朝忠、達(dá)娃等人報(bào)道的結(jié)果一致[3-7]；MPV、PDW在兩組間比較接近臨界值，可能與觀察樣本量小有關(guān)。血小板的功能與血栓形成、血管收縮等密切相關(guān)，完全取決于黏附、聚集、變形與釋放等生理活性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)血小板在全身炎癥性反應(yīng)疾病、免疫疾病及腫瘤疾病的轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著重要作用[8-10]，高原環(huán)境對(duì)血小板的生理活性和功能有一定的影響，低氧環(huán)境暴露下血小板聚集能力增強(qiáng)、活性增高[11，12]，血小板的數(shù)量和功能改變均會(huì)導(dǎo)致凝血障礙性疾病及血栓性疾病的發(fā)生。既往研究報(bào)道高原環(huán)境引起血小板減少的原因包括：紅系過度增殖及缺氧造成的血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致在循環(huán)中血小板破壞增加[4，13]；紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞來自相同的巨核細(xì)胞-紅系祖細(xì)胞(megakaryocytes-erythroid progenitors，MEP)[14]，在高原環(huán)境下存在干細(xì)胞競(jìng)爭分化，有限的MEP會(huì)優(yōu)先向紅系分化，出現(xiàn)周期性的血小板數(shù)量減少[15]。也有學(xué)者[16]認(rèn)為長期低氧環(huán)境會(huì)造成MEG成熟障礙及成熟血小板的生成減少；還有報(bào)道認(rèn)為高原人群脾指數(shù)較平原人大，脾大引起血小板破壞過多[17]。生理狀態(tài)下細(xì)胞生成與死亡應(yīng)保持動(dòng)態(tài)平衡，而在CMS患者血小板減少機(jī)制中的MEG代謝如何變化，目前未見報(bào)道。本研究選擇藏族男性中年CMS患者和藏族健康者進(jìn)一步進(jìn)行骨髓MEG增殖率、凋亡率的測(cè)定，旨在盡量消除遺傳背景、習(xí)服時(shí)間和性別、年齡等因素的干擾。

MEG是血小板的前體細(xì)胞，經(jīng)歷了造血干細(xì)胞自我更新與分化，分化為巨核系祖細(xì)胞，進(jìn)一步分化并增殖為成熟MEG，生成并釋放血小板。成人MEG表達(dá)的CD41(integrinα-IIb)、CD61(integrin β3)、CD42b(glycoprotein Ibα)水平較一致[18]。CD41是區(qū)分MEG的重要標(biāo)志物[14]，CD61是MEG系特異性標(biāo)記[19]，所以我們?cè)谘芯恐羞x擇了CD41、CD61。

目前已明確血小板的形成、釋放與MEG凋亡密切相關(guān)：MEG凋亡減少導(dǎo)致血小板釋放減少[20，21]。本研究測(cè)得兩組間MEG凋亡率存在明顯差異，CMS組較CON組低，表明MEG凋亡減少可能是血小板減少的部分機(jī)制。凋亡通路中存在眾多的調(diào)控分子。細(xì)胞凋亡通路中caspase的激活，特別是caspase-3的激活，對(duì)細(xì)胞終末分化和促進(jìn)凋亡至關(guān)重要[22，23]。凋亡抑制蛋白Bcl-2在早期MEG中表達(dá)，過量表達(dá)Bcl-2可以有效抑制前血小板的產(chǎn)生[24]。Bax是一種MEG凋亡所必需的內(nèi)源性促凋亡蛋白。故本研究選擇凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bcl-2、Bax進(jìn)行研究。

CMS組骨髓MEG增殖率較CON組高，可能是對(duì)血小板減少的一種代償性調(diào)節(jié)。同時(shí)，在回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，藏族CMS組PDW、P-LCR較藏族體檢組高，反映了MEG新生血小板數(shù)量增加[25]。因?yàn)樾律“寰哂懈鼜?qiáng)的功能，所以血小板雖有一定數(shù)量的減少，但仍能保持基本功能，這也是機(jī)體的一種適應(yīng)性變化。

血小板生成素(thrombopoietin，TPO)受體C-MPL是TPO的配體，在控制MEG生成、增殖、分化過程中起重要作用。C-MPL一方面通過與TPO結(jié)合，促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞和MEG增殖、分化，促進(jìn)MEG成熟并產(chǎn)生血小板；另一方面又能通過血小板上的TPO結(jié)合位點(diǎn)，清除并使TPO代謝，從而維持血小板代謝平衡。黃菊等人研究發(fā)現(xiàn)免疫性血小板減少癥患者多伴有內(nèi)源性TPO不足，同時(shí)伴有C-MPL不足[26]。我們觀察到CMS組C-MPL 表達(dá)水平較CON組高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明高原環(huán)境下的C-MPL表達(dá)受諸多因素影響。

綜上所述，在高原環(huán)境下，本研究組藏族男性中年CMS患者PLT較藏族健康者低；同時(shí)，MEG凋亡減少，可能是血小板減少的原因之一。另外，骨髓MEG增殖旺盛，可能是對(duì)血小板減少的一種代償性反應(yīng)。與漢族相關(guān)情形無差異。