陳 曄，蔣冬先，劉玉鳳，宋 琦，徐 磊，宿杰阿克蘇，侯英勇

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，包括食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）。ESCC是中國(guó)最常見的食管癌組織類型。盡管治療水平不斷提高，但ESCC的5年生存率仍低于20%。目前認(rèn)為ESCC發(fā)病的高危因素包括遺傳因素、飲食因素和環(huán)境因素［1-2］。研究［3-4］表明，TP53、RB1和NOTCH1等 基 因 在ESCC中 發(fā) 揮著重要作用。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多基因、多步驟的過程，所以本研究主要探討是否有其他基因影響ESCC的預(yù)后。鋅指蛋白24（ZNF24）也稱為ZNF191或KOX17，在胚胎發(fā)育和成人組織中廣泛表達(dá)［5-6］。研究［7-8］發(fā)現(xiàn)，敲除ZNF24會(huì)導(dǎo)致發(fā)育過程中胚胎的過早死亡，說明ZNF24在器官發(fā)育過程中起著重要作用。除了調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的功能，ZNF24在癌癥起始和進(jìn)展的關(guān)鍵過程中發(fā)揮重要作用，如參與調(diào)控肝細(xì)胞癌和胃癌的增殖、分化、遷移和侵襲。然而，ZNF24在ESCC中的分子作用和臨床意義尚不清楚。因此，本研究利用組織芯片采用免疫組織化學(xué)（IHC）法檢測(cè)513例ESCC中ZNF24蛋白的表達(dá)，旨在探討其表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系及其對(duì)ESCC患者的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2007年—2010年復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的ESCC標(biāo)本513例。所有患者術(shù)前未行放療、化療。H-E切片由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立確認(rèn)ESCC診斷，臨床病理參數(shù)：年齡，性別，腫瘤大?。ㄒ? cm分為兩組），腫瘤位置（食管上段、中段及下段），吸煙史，分化程度（高、中、低），浸潤(rùn)深度（Ⅰ：局限于黏膜下層、Ⅱ：侵犯肌層、Ⅲ：突破肌層），脈管及神經(jīng)侵犯與否，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期（分Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ+Ⅳa兩組）。本研究獲復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（B2021-178R）。所有患者或家屬均簽署書面知情同意書。

1.2 組織芯片（TMA）的制備 選取H-E切片中具有代表性的區(qū)域，從每例蠟塊中取出寬2 mm、長(zhǎng)6 mm的組織垂直放置于新的蠟塊中，制作組織芯片，每個(gè)組織芯片包含70個(gè)病例。

1.3 IHC檢測(cè) TMA取4 μm切片，脫蠟至水，抗原修復(fù)液（pH 9.0）中加熱10 min。一抗為ZNF24（稀釋比1∶50，Abcam公司），使用全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)Aliya進(jìn)行免疫組化Compact Polymer法染色。

1.4 結(jié)果判讀 ZNF24染色陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。TMA中ZNF24的表達(dá)情況由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立評(píng)估。IHC評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無陽(yáng)性染色為0分；弱染色為1分；弱到中度染色為2 分；中度到強(qiáng)染色為3分。分別統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞比例，計(jì)算H-score評(píng)分（強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞比例）。

1.5 隨 訪 513例患者的隨訪資料來自于病歷記錄、電話隨訪和家訪。隨訪時(shí)間截至2018年12月。無病生存期（disease free survival, DFS）和總生存期（overall survival，OS）是從手術(shù)時(shí)間到首次復(fù)發(fā)時(shí)間（最后隨訪時(shí)間）或死亡時(shí)間計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)數(shù)資料間的比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，生存期間的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。使用Cox回歸模型進(jìn)行單因素和多因素生存分析。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0版本, 檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征 513例（男性420例，女性93例）ESCC患者平均年齡為61.2歲（34～83歲）。201例有吸煙史。295例腫瘤直徑小于3 cm，218例腫瘤直徑大于3 cm。腫瘤位置以中下段為主。96.5%的病例為中、低分化。腫瘤的浸潤(rùn)深度多侵及肌層及外膜層。115例（22.4%）存在脈管癌栓，178例（34.7%）存在神經(jīng)侵犯，239例（46.6%）出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。依據(jù)第8版AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)，281例（54.8%）為臨床Ⅰ＋Ⅱ期，232例（45.2%）為臨床Ⅲ＋Ⅳa期。513例ESCC患者中，5個(gè)臨床病理參數(shù)與較差的預(yù)后具有明顯相關(guān)性，分別為浸潤(rùn)深度（DFS，P＜0.001；OS，P＜0.001）、脈管侵犯（DFS，P＝0.001；OS，P＝0.001）、神經(jīng)侵犯（DFS，P＝0.001；OS，P＝0.004）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（DFS，P＜0.001；OS，P＜0.001）和臨床分期（DFS，P＜0.001；OS，P＜0.001）。

2.2 ZNF24蛋白的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 ZNF24蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色，定位于細(xì)胞核（圖1）。為了選擇最佳的界限值，本研究根據(jù)生存狀態(tài)繪制受試者工作特征（ROC）曲線，確定以評(píng)分1.5為閾值，分為低表達(dá)組（135例，26.3%）和 高 表 達(dá) 組（378例，73.7%）。ZNF24表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、脈管與神經(jīng)侵犯與否、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期無明顯相關(guān)性，但與腫瘤大小顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001），和腫瘤位置顯著正相關(guān) （P＝0.038，表1）。

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌中ZNF24的蛋白表達(dá)A：ZNF24低表達(dá)；B：ZNF24高表達(dá)。Original magnification：× 100。

表1 513例ESCC患者中ZNF24表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 ESCC患者的生存分析 患者的中位隨訪時(shí)間為35個(gè)月（3～102個(gè)月），DFS和OS的5年生存率分別為68.6%和68.0%。DFS的平均隨訪時(shí)間和中位隨訪時(shí)間分別為41.2個(gè)月和30個(gè)月，OS的平均隨訪時(shí)間和中位隨訪時(shí)間分別為44.5個(gè)月和35個(gè)月。

ZNF24高 表 達(dá) 組 的DFS（P＝0.524）和OS （P＝0.527）均比ZNF24低表達(dá)組縮短，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察DFS和OS的生存曲線，分別于28個(gè)月及35個(gè)月后差異逐漸明顯。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DFS大于28個(gè)月時(shí)，ZNF24高表達(dá)組生存期顯著縮短（P＝0.035）；當(dāng)OS大于35個(gè)月時(shí)，ZNF24高表達(dá)組生存期顯著縮短（P＝0.036，圖2）。

圖2 Kaplan-Meier分析DFS和OS與ZNF24蛋白表達(dá)的關(guān)系A(chǔ)、B：在513例ESCC患者中，ZNF24高表達(dá)組的DFS和OS 預(yù)后均較差；C：275例DFS≥28個(gè)月的ESCC患者中，ZNF24高表達(dá)組預(yù)后比低表達(dá)組顯著變差（P＝0.035）；D：261例OS≥35個(gè)月的ESCC患者中，ZNF24高表達(dá)組預(yù)后比低表達(dá)組顯著變差（P＝0.036）。

單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)深度、脈管及神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期與DFS（表2）和OS（表3）相關(guān)；多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者獨(dú)立預(yù)后因子，ZNF24蛋白高表達(dá)并不是ESCC的獨(dú)立預(yù)后因子。

表2 單因素和多因素Cox回歸模型分析與ESCC患者DFS相關(guān)的危險(xiǎn)因素

表3 單因素和多因素Cox回歸模型分析與ESCC患者OS相關(guān)的危險(xiǎn)因素

3 討論

ZNF24是類Kruppel鋅指基因家族的一員，其N端含有1個(gè)SCAN結(jié)構(gòu)域，SCAN結(jié)構(gòu)域由富含亮氨酸區(qū)域組成高度保守的模體，用來調(diào)節(jié)與其他含有SCAN結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)之間相互作用［9］。ZNF24被認(rèn)為是一種調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和發(fā)育的蛋白質(zhì)［10］，參與胚胎發(fā)育［7］和造血［11］，并被證明在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［12］。

ZNF24在不同的惡性腫瘤中有著完全不同的表達(dá)模式和腫瘤相關(guān)作用。在肝細(xì)胞癌中，ZNF24的表達(dá)高于正常肝組織，可直接與β-catenin啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞增殖［13］。ZNF24還可增加WNT8B啟動(dòng)子在肝細(xì)胞癌中的轉(zhuǎn)錄活性，從而上調(diào)WNT8B的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，進(jìn)而通過Wnt信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［14］。盡管ZNF24有促增殖的作用，但能夠抑制肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移［15］。在三陰性乳腺癌中，ZNF24表達(dá)上調(diào)，microRNA-940通過直接靶向ZNF24，在細(xì)胞增殖和遷移中起腫瘤抑制作用［16］。Jia等［17］發(fā)現(xiàn)，ZNF24通過直接結(jié)合VEGF近端啟動(dòng)子，作為腫瘤血管生成的負(fù)調(diào)控因子，從而抑制VEGF轉(zhuǎn)錄。ZNF24的異常表達(dá)同時(shí)也在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中被發(fā)現(xiàn)，并顯示出預(yù)后預(yù)判意義［18］。

然而，ZNF24在ESCC中的作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)ZNF24在513例ESCC中蛋白過表達(dá)，陽(yáng)性率為73.7%。這與ZNF24在前列腺癌組織和細(xì)胞系中均過表達(dá)的結(jié)果一致［6］。ZNF24位于染色體18q12.1，在直腸癌中該區(qū)域經(jīng)常缺失，提示ZNF24在腫瘤生長(zhǎng)中可能起負(fù)調(diào)控作用［19-20］。本研究還發(fā)現(xiàn)，ZNF24蛋白高表達(dá)與ESCC的腫瘤大小具有顯著的負(fù)相關(guān)性。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)ZNF24高表達(dá)的患者有預(yù)后較差的趨勢(shì)（DFS，P＝0.524；OS，P＝0.527），尤其是當(dāng)DFS大于28個(gè)月時(shí)，ZNF24高表達(dá)患者生存期顯著縮短（P＝0.035）。當(dāng)OS大于35個(gè)月時(shí)，ZNF24高表達(dá)患者生存期也顯著縮短（P＝ 0.036），該結(jié)果提示ZNF24可能是ESCC預(yù)后不良的重要參考指標(biāo)。這表明ESCC中ZNF24基因表達(dá)的調(diào)控途徑可能與肝癌不同。筆者猜想，ZNF24在腫瘤手術(shù)切除后，或在不同的微環(huán)境下，基因的表達(dá)不同，ZNF24在惡性腫瘤中的雙重作用可能與其多個(gè)鋅指區(qū)域相關(guān)。人群、檢測(cè)方法及臨界值的差異也是潛在的原因。這些結(jié)果表明，ZNF24在不同的組織中扮演著不同的角色，可能是ESCC的藥物靶點(diǎn)之一。

本研究首次報(bào)道了ZNF24與ESCC的預(yù)后關(guān)系，但主要側(cè)重于闡明其臨床意義，并未在分子水平上充分探討其作用機(jī)制，進(jìn)一步研究其信號(hào)通路將為一種新的藥物靶點(diǎn)提供可能。本研究表明ZNF24在ESCC中蛋白過表達(dá)，高表達(dá)的患者DFS和OS預(yù)后均較差，尤其是當(dāng)DFS大于28個(gè)月和OS大于35個(gè)月時(shí)，ZNF24是ESCC預(yù)后不良的重要參考指標(biāo)。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。