周年偉，翁灝博，田芳艷，孟芳民，馬 靜，潘翠珍，舒先紅*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心臟超聲診斷科，上海市影像醫(yī)學(xué)研究所，上海 200032 2.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海 200032

擴(kuò)張型心肌病（dilated cardiomyopathy, DCM） 是一種原因未明的原發(fā)性心肌疾病，主要特征為心室擴(kuò)大，并伴有心室收縮功能異常，早期以心律失常多見［1］?；颊卟∏槌蔬M(jìn)行性加重，死亡可發(fā)生于疾病的任何階段。Verdonschot等［2］的臨床研究發(fā)現(xiàn)，人群中擴(kuò)張型心肌病的發(fā)病率約為 1/2500，分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)基因突變是患者的主要病因之一。突變基因主要與心肌細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞核膜、離子通道等基因有關(guān)。擴(kuò)張型心肌病患者的臨床表現(xiàn)差異較大，從無癥狀到心律失常，嚴(yán)重者表現(xiàn)為心力衰竭甚至猝死。同時，擴(kuò)張型心肌病與其他心肌病，如肥厚型心肌病、限制型心肌病在臨床表現(xiàn)及基因突變上都有重疊，相同的臨床表現(xiàn)可能致病基因不同，相同的基因突變可以出現(xiàn)不同的臨床表型，因此給臨床診治帶來較大的困難［3］。隨著基因測序技術(shù)的進(jìn)步，特別是高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，基因篩查日趨精準(zhǔn)，極大地促進(jìn)了遺傳性心血管病的診斷和治療。本研究應(yīng)用全外顯子組測序技術(shù)，對1個擴(kuò)張型心肌病患者家系進(jìn)行了致病基因的篩查。

1 資料與方法

1.1 先證者及家系資料 2019年4月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治1例擴(kuò)張型心肌病先證者（Ⅱ-3，圖1）?；颊?4歲，男性，反復(fù)胸悶、氣短11年，休息數(shù)分鐘后可緩解，外院診斷為擴(kuò)張型心肌病，8年前患者出現(xiàn)頭暈、暈厥等癥狀，外院心電圖檢查示心動過緩，遂在外院植入心臟起搏器?；颊?7 d前再次出現(xiàn)胸悶氣急、雙下肢水腫，癥狀加重，于我院急診入院，患者的心電圖（圖2A）示心房顫動，呈VVI形式起搏，帶動良好?；颊叱曅膭訄D檢查（圖2B）示心臟明顯增大，少量心包積液，左右心室整體收縮活動減弱，左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）為33%。患者的X線胸部平片（圖2C）示心影增大。氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide，NT-proBNP）顯著升高，經(jīng)對癥治療后好轉(zhuǎn)。

進(jìn)一步詢問家族史發(fā)現(xiàn)，患者哥哥及母親均有心臟病病史，且其母親既往因心臟病于32歲時去世?；颊吒绺纾á?2，圖1），47歲，既往病史及檢查資料提示：心臟生化指標(biāo)及冠脈CT均無明顯異常，可排除冠脈病變導(dǎo)致的心功能異常；進(jìn)一步復(fù)查心電圖、心超等，診斷房顫、房室傳導(dǎo)阻滯和左心室功能不全，心臟超聲檢查（圖2D）示左室擴(kuò)大伴左室收縮活動減弱，LVEF為45%，符合擴(kuò)張型心肌病的診斷。

圖1 先證者的家系圖（A）及家系成員突變位點Sanger測序圖（B）

圖2 先證者家系的臨床檢查資料A：患者心電圖；B：患者的超聲心動圖；C：患者的X線胸部平片；D: 患者哥哥的超聲心動圖。

1.2 一般臨床資料 收集該家系中所有相關(guān)成員的臨床資料，包括超聲心動圖、心電圖、發(fā)病年齡、紐約心功能評級、初發(fā)癥狀、血清肌酸激酶等。同時進(jìn)行體格檢查，并根據(jù)需要行動態(tài)心電圖檢查。所有研究對象簽署知情同意書后，采集其外周血標(biāo)本，按照試劑盒說明書步驟提取DNA，送檢測序。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)［B2016-016(2)R］。

1.3 全外顯子組測序和分析 根據(jù)家系中患者及家族成員的臨床表型，對3名家族成員(Ⅰ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3，圖1）的外周血DNA行全外顯子組測序。檢測樣本抽提核酸，采用超聲打斷，用TruSeq DNA Sample Preparation 試劑盒處理兩端連接測序接頭構(gòu)建成測序文庫，采用PE125格式，使用Roche Nimblegen SeqCap EZ v5.1試劑盒捕獲全外顯子區(qū)域，采用illumina XTEN平臺進(jìn)行高通量測序，數(shù)據(jù)質(zhì)量Q30比例大于90%，95%目標(biāo)區(qū)域測序深度＞30×。原始序列讀取根據(jù)人類基因組GRCh37進(jìn)行映射，并使用langya進(jìn)行注釋分析，langya自動執(zhí)行BWA映射和Freebayes變量調(diào)用，然后根據(jù)內(nèi)部和公共數(shù)據(jù)庫以及遺傳模型擬合進(jìn)行過濾。變異和臨床診斷關(guān)鍵詞被傳遞到基于科學(xué)和臨床文獻(xiàn)NLP的搜索引擎。篩選過濾明確致病基因突變位點，后續(xù)對家族成員的DNA進(jìn)行Sanger測序以確認(rèn)其基因突變位點，并對家族成員進(jìn)行家族共分離驗證分析。

2 結(jié)果

2.1 全外顯子測序結(jié)果 對先證者及家系成員行全外顯子組測序，通過數(shù)據(jù)過濾及生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該擴(kuò)張型心肌病患者家系的致病基因突變位點為MYH7 c.2458G＞C（p.Ala820Pro）。該位點在人群中突變頻率低，既往研究未見有報道，為漢族人群中首次發(fā)現(xiàn)。

2.2 MYH7基因突變位點的生物信息學(xué)分析 通過生物信息學(xué)分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，該位點在不同物種中為高度保守區(qū)域。在家族成員中進(jìn)一步驗證，只有先證者及其哥哥攜帶該MYH7突變位點，共分離驗證分析顯示該基因型與臨床表型在家系內(nèi)表現(xiàn)一致。

圖3 MYH7突變位點氨基酸序列保守性分析

MYH7編碼心肌肌小節(jié)β肌球蛋白重鏈蛋白，其突變可以導(dǎo)致心肌肥厚及心肌收縮功能異常。本研究中發(fā)現(xiàn)的MYH7基因突變位點預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)為致病，其組成蛋白結(jié)構(gòu)單元中的氨基酸在不同物種間高度保守，突變之后會對蛋白功能產(chǎn)生較嚴(yán)重的影響，因此患者臨床表現(xiàn)為心臟收縮功能的異常，同時在家系其他成員中表現(xiàn)為心臟結(jié)構(gòu)或心電活動的異常。

3 討論

擴(kuò)張型心肌病以心臟擴(kuò)大伴心室收縮功能障礙為主要表現(xiàn)，患者的預(yù)后通常較差，初次診斷后的5年存活率低于50%，晚期常死于心力衰竭，這也是心臟移植的常見原因之一［4］。遺傳和非遺傳因素在擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生和發(fā)展中共同作用，導(dǎo)致患者臨床表現(xiàn)各不相同［5-6］。目前研究［7］發(fā)現(xiàn)，超過 60個基因與擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生有關(guān)，部分的擴(kuò)張型心肌病患者通過基因篩查找到了相關(guān)的致病的基因突變，但目前擴(kuò)張型心肌病與基因突變之間關(guān)系的了解仍不全面，基因突變導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病發(fā)病的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

擴(kuò)張型心肌病如能及時得到診斷治療，患者將在很大程度上減少心血管意外事件的發(fā)生。隨著基因測序技術(shù)的進(jìn)步，遺傳性心肌病的基因診斷有了飛躍式進(jìn)步。高通量測序技術(shù)可以在短時間內(nèi)獲得大量遺傳信息，在快速尋找致病基因突變、明確診斷、精準(zhǔn)治療和產(chǎn)前咨詢等方面有廣闊前 景［8-9］。同時隨著基因測序大數(shù)據(jù)的積累，科研工作者的不斷探索，基因的診斷及治療都出現(xiàn)了革命性的轉(zhuǎn)變，準(zhǔn)確性及安全性都已經(jīng)非常高，特別是在危重癥及疑難病的診治方面，對擴(kuò)張型心肌病患者及家系成員進(jìn)行基因檢測有重要價值［10］。

MYH7是人類第14號染色體上的1個基因，主要編碼心肌纖維中的β肌球蛋白重鏈。肌球蛋白是最保守的收縮蛋白，它構(gòu)成肌節(jié)粗絲的主 干［11］。在心肌細(xì)胞的能量供應(yīng)和維持心肌細(xì)胞內(nèi)外Ca2＋的濃度中發(fā)揮重要作用，β肌球蛋白重鏈?zhǔn)蔷哂忻富钚缘男呐K收縮蛋白，可以將ATP水解成ADP和Pi，并通過肌小節(jié)的酶促動力反應(yīng)和收縮偶聯(lián)機(jī)制調(diào)節(jié)心肌收縮功能［12］。MYH7基因突變相關(guān)心肌病主要包括肥厚型心肌病和擴(kuò)張型心肌?。?3］。本研究通過全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)1個擴(kuò)張型心肌病患者家系中新的MYH7突變位點，該位點在漢族人群中尚未見報道。MYH7導(dǎo)致心肌病的機(jī)制目前還未完全明了，既往研究［4］報道與突變導(dǎo)致肌小節(jié)的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能異常等有關(guān)。本研究中，該心肌病家系先證者在MYH7基因中存在1個新突變，攜帶該突變位點的家族成員的心功能異常，突變位點在家系內(nèi)符合基因表型共分離關(guān)系。本研究中發(fā)現(xiàn)的罕見突變位點位于蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測為有害的保守區(qū)域， MYH7的突變c.2458G＞ C（p.Ala820Pro）為新的漢族人群擴(kuò)張型心肌病致病突變位點，后續(xù)將在更大的心肌病人群中驗證該位點的致病性，同時探尋可能的致病機(jī)制。

綜上所述，由于擴(kuò)張型心肌病可在各年齡階段發(fā)病，且臨床表現(xiàn)差異較大，不同基因突變位點的外顯率各不相同，給臨床診斷帶來了較大困難［12,14］。全外顯子組測序能夠?qū)崿F(xiàn)高度準(zhǔn)確的基因突變篩查，可更廣泛地應(yīng)用于檢測心肌病基因突變。

利益沖突：所有作者聲明均不存在利益沖突。