胡心嶼，宋麗君，譚 麗，李 奇，李福龍

1.河北北方學(xué)院，張家口 075000 2.海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，上海 200003 3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，張家口 075000

銅綠假單胞菌是一種條件性致病菌，也是院內(nèi)獲得性肺炎（hospital acquired pneumonia，HAP）的主要病原菌［1-2］。銅綠假單胞菌引發(fā)的感染多發(fā)生在免疫力低下，皮膚黏膜受損或是ICU長期體內(nèi)留置氣管導(dǎo)管和導(dǎo)尿管等患者人群中［3-4］。近年來，隨著抗生素的廣泛使用，耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的數(shù)量與日俱增，越發(fā)影響著人們的健康和生活［5］。根據(jù)一項(xiàng)2013—2018年在美國進(jìn)行的回顧性隊(duì)列研究［6］，23331例復(fù)雜尿路感染住院患者中，銅綠假單胞菌感染占三重（包括氟喹諾酮、第三代頭孢菌素、磷霉素、呋喃妥因和甲氧芐啶-磺胺甲唑中3種以上）耐藥感染的8.03%，僅次于大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌和變形桿菌。根據(jù)2018版中國成人醫(yī)院獲得性肺炎和呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎（ventilator associated pneumonia，VAP）的診治指南［7］，銅綠假單胞菌感染占HAP的18.7%～20.0%，占VAP的12.5%～27.5%，僅次于鮑曼不動桿菌感染，并且老年患者中更多見。并且銅綠假單胞菌還可依據(jù)生存環(huán)境的不同轉(zhuǎn)化成不同的生存方式。銅綠假單胞菌可在免疫受損的宿主中引起侵襲性感染，例如急性肺炎或血液感染。但是在另外一些情況下，銅綠假單胞菌還會導(dǎo)致持續(xù)的慢性感染，例如患有遺傳性疾病囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）的患者，銅綠假單胞菌以生物膜的形式抵抗宿主的清除作用［8］。預(yù)防銅綠假單胞菌的感染對于減緩CF疾病的進(jìn)展至關(guān) 重要。

雜交瘤技術(shù)是在體細(xì)胞融合技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，將骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動物脾細(xì)胞融合，形成能分泌針對抗原的高特異性抗體——單克隆抗體（單抗），在臨床上具有良好的治療效果［9］。單抗的問世及人鼠嵌合型甚至全人源抗體的出現(xiàn)，消除了鼠源抗體Fc導(dǎo)致的不良反應(yīng)，為抗感染治療增加了新的方法［10-11］。最近一項(xiàng)關(guān)于來自康復(fù)期COVID-19患者的人單抗對SARS-CoV-2感染的治療研究［12］中，人單抗避免了發(fā)生抗體依賴性疾病加重（antibody-dependent enhancement，ADE）的風(fēng)險(xiǎn)。

纈氨酸甘氨酸重復(fù)蛋白G（VgrG）是銅綠假單胞菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)（type Ⅵ secretion system，T6SS）的一種結(jié)構(gòu)性蛋白，多在其尖端連接特異性的效應(yīng)因子，并將其遞送到原核或真核細(xì)胞內(nèi)［13］。因銅綠假單胞菌含有不同功能的效應(yīng)子，所以相應(yīng)地也存在可以互相匹配的不同的VgrGs［14］。部分VgrG進(jìn)化出了脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸（prolinealanine-alanine-arginine，PAAR）功能結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生內(nèi)化上皮細(xì)胞的作用［15-16］。本研究中涉及的是經(jīng)典的VgrG1a蛋白，只發(fā)揮傳送毒素的作用，目前尚未發(fā)現(xiàn)此蛋白的其他生物學(xué)功能。銅綠假單胞菌通過T6SS的VgrG1a分泌一種針對靶細(xì)胞能量的氧化型輔酶Ⅰ或輔酶Ⅱ NAD(P)＋，抑制原核生物生長和代謝［17］。本實(shí)驗(yàn)通過原核系統(tǒng)表達(dá)VgrG1a蛋白，免疫小鼠制備出鼠源和人源化的單抗，為深入探討VgrG1a蛋白在銅綠假單胞菌T6SS相關(guān)感染的功能起到了鋪墊作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、細(xì)胞和菌株 從北京擎科生物

科技有限公司購買Escherichia coliBL21（DE3）plysS；5%兔血紅細(xì)胞購自森貝伽生物科技有限公司；Expi293細(xì)胞購自Thermo公司；從上海斯萊克有限公司購買6～8周齡的BABL/c小鼠；骨髓瘤細(xì)胞P3X63Ag8.653購自中科院細(xì)胞庫。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化 從NCBI網(wǎng)站上查找關(guān)于VgrG1a的序列信息，并將序列插入到pET-21a質(zhì)粒中（添加6×His標(biāo)簽和Amp抗性以備純化和篩選用）送公司合成，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，篩選陽性單菌落，即為成功表達(dá)目的蛋白VgrG1a的菌株。

1.3 VgrG1a重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化和透析置換 將表達(dá)VgrG1a的大腸桿菌在Luria-Bertani（LB）＋氨芐西林（ampicillin簡寫為Amp，1∶ 1000稀釋）培養(yǎng)板上活化兩代后，挑單菌落到無菌LB＋Amp（1∶1000稀釋）的液體培養(yǎng)基中，37℃搖床200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，測600 nm處光密度為0.6～0.8時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)劑（0.5 mmol/L）。將溫度降至16℃繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，離心收集菌液沉淀。

菌液于0℃超聲至透亮（10 mm探頭，每超聲3 s暫停3 s ，共破碎至少100次），13000 r/min 離心30 min分別收集上清和菌沉淀，沉淀用無菌PBS稀釋后準(zhǔn)備SDS-PAGE分析，上清則用 0.22 μm濾頭過濾后與鎳柱混懸30 min充分結(jié)合。在填料柱中洗脫，雜蛋白用0.5×Binding Dilution（簡稱為BD）液去除至蛋白顯色液不變藍(lán)，目的蛋白用1×Binding Buffer（簡稱為BB）液洗脫至顯色液無色。將收集的目的蛋白液裝入透析袋，用含25 mmol/L HEPES（pH 8.0）的透析液置換溶劑中的咪唑，每2 h換1次透析液直至透析干凈。將目的蛋白定量測濃度后低溫保存。

1.4 VgrG1a重組蛋白的鑒定和檢測 少量上清、無菌PBS稀釋后的沉淀和透析后的目的蛋白分別加入DTT和5×Loading Buffer制成樣品，煮沸后準(zhǔn)備SDS-PAGE用。樣品在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳至條帶分離清晰后，用考馬斯亮藍(lán)染色，去離子水洗凈拍照。

將VgrG1a重組蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠上后120 V恒壓電泳120 min后，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜。用TBST（Tris buffered saline Tween）緩沖液封閉后洗凈，再轉(zhuǎn)移到含多聚組氨酸標(biāo)簽（His-tag）抗體的小鼠一抗稀釋液浸泡過夜。洗凈一抗后，用山羊抗小鼠IgG二抗37℃結(jié)合1 h，最后用反應(yīng)液顯色。

1.5 VgrG1a重組蛋白的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 將VgrG1a蛋白濃度稀釋至1 μg/mL置于96孔酶標(biāo)板中4℃過夜。用含0.05%吐溫20的PBS緩沖液洗板3次。再用5%牛血清白蛋白（BSA）于37℃封閉1 h后再次洗板，加入相應(yīng)抗體（2 μg/mL）4℃過夜培養(yǎng)。用PBS清洗干凈后用山羊抗小鼠IgG抗體（2 μg/mL，1:10000稀釋）在37℃孵箱結(jié)合1 h后，再次清洗干凈，在四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色后加入2N硫酸溶液終止反應(yīng)，測450 nm處光密度值。

1.6 抗VgrG1a蛋白鼠源單抗的制備和篩選 參考冷泉港免疫法免疫。分別在BALB/c小鼠腹股溝、尾根、頸背部皮下和腹腔注射混有弗氏佐劑（首次用完全型，其余用不完全型）的25 μg目的蛋白混懸液。每隔2周免疫，共免疫3次后尾靜脈加強(qiáng)免疫1次。除首次免疫蛋白量為25 μg外，其余均為12.5 μg。第5周小鼠尾尖采血200 μL，取血清進(jìn)行ELISA檢測。

將免疫后的小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤P3X63Ag8.653細(xì)胞按照4∶1比例在聚乙二醇（PEG）的作用下進(jìn)行融合，并用含10%血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)。300×g室溫離心棄上清后，再用含20%血清培養(yǎng)基重懸融合細(xì)胞，調(diào)整密度為每孔1×105個細(xì)胞培養(yǎng)。融合第2天補(bǔ)充含HAT（H：Hypoxanthine次黃嘌呤，A：Aminopterin氨基蝶呤；T：Thymidine胸腺嘧啶核苷）的選擇培養(yǎng)基。第10天更換為含HT的篩選培養(yǎng)基。在融合2周后，未融合細(xì)胞消失，根據(jù)細(xì)胞生長情況檢測上清中特異性抗體與VgrG1a蛋白的親和力。采用有限稀釋法將雜交瘤細(xì)胞稀釋到約每孔1個細(xì)胞后，在96孔板中培養(yǎng)，挑選單克隆細(xì)胞檢測上清中特異性抗體與VgrG1a蛋白的親和力。

1.7 抗VgrG1a蛋白的人鼠嵌合型單抗的制備 將篩選出的鼠源單抗測序后，設(shè)計(jì)成質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。提取出完整質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Expi293細(xì)胞。37℃搖床培養(yǎng)48 h后收集含抗體的上清，用Protein A磁珠進(jìn)行純化。

用含0.1%吐溫的Washing Buffer洗雜蛋白直至蛋白顯色液不變藍(lán)。用含0.05 mol/L檸檬酸的Elution Buffer洗脫目的蛋白（加入適量1 mol/L Tris HCl中和）直至蛋白顯色液不變藍(lán)。然后用PBS（pH 7.2）緩沖液，2800×g離心5 min置換洗脫液。使用過后的Protein A用0.1 mol/L NaOH去除蛋白后，乙醇重懸，4℃保存。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果用x±s表示，關(guān)于VgrG1a重組蛋白與His標(biāo)簽抗體親和力的ELISA檢驗(yàn)，用多因素方差進(jìn)行分析，并用Tukey法進(jìn)行多重比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。ELISA結(jié)果均使用GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪制擬合曲線。

2 結(jié)果

2.1 VgrG1a基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化后鑒定 在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索得到銅綠假單胞菌VgrG1a蛋白的序列信息，合成得到質(zhì)粒pET21a-VgrG1a。VgrG1a蛋白的相對分子質(zhì)量約為72000。 將pET21a-VgrG1a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，待含pET21a-VgrG1a質(zhì)粒的菌液D600達(dá)到0.6～0.8后，添加0.5 mmol/L IPTG，在搖床中200 r/min震蕩培養(yǎng)，觀察上清，菌沉淀和純化的蛋白中相對分子量72000處目的蛋白含量的變化。對比菌液在37℃搖床中200 r/min培養(yǎng)6 h的結(jié)果（圖1 A），發(fā)現(xiàn)最佳誘導(dǎo)條件為待菌液D600達(dá)到0.6～0.8后，添加0.5 mmol/L IPTG，在16℃搖床中200 r/min培養(yǎng) 16 h（圖1B）。

圖1 VgrG1a蛋白的表達(dá)與誘導(dǎo)在不同誘導(dǎo)條件下得到的菌液上清、菌沉淀（A）以及純化后得到的VgrG1a蛋白（B）。泳道1、6、8：Marker；泳道2、3、7：分別為37℃，6 h，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的上清、沉淀和VgrG1a蛋白；泳道4、5、9：分別為16℃，16 h，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的上清、沉淀和VgrG1a蛋白。

在16℃誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白，在通過0.5倍BD洗脫液去除雜蛋白后，相對分子質(zhì)量72000處條帶較明顯且含量較高，相對分子質(zhì)量25000處條帶可能為目的蛋白的降解成分（圖2 A）。同樣經(jīng)Western 印跡確認(rèn)各條帶都含有His標(biāo)簽，推測VgrG1a重組蛋白易降解（圖2 B）。

為檢測VgrG1a重組蛋白是否含有6×His標(biāo)簽的目的蛋白，分別將VgrG1a蛋白和帶有6×His標(biāo)簽的金黃色葡萄球菌α溶血素蛋白包被同一塊96孔酶標(biāo)板（來自本課題組的金黃色葡萄球菌α溶血素為陽性對照，BSA溶液為陰性對照）。分別與抗6×His抗體溶液、小鼠IgG抗體溶液和PBS溶液過夜培養(yǎng)檢測其親和力（圖2 C）。并通過方差分析，檢驗(yàn)得出VgrG1a重組蛋白與6×His抗體稀釋液為特異性結(jié)合，即純化后的VgrG1a重組蛋白為目的蛋白。

圖2 誘導(dǎo)表達(dá)的VgrG1a重組蛋白的鑒定A：VgrG1a重組蛋白的SDS-PAGE結(jié)果；B：Western印跡鑒定VgrG1a蛋白各條帶是否為6×His標(biāo)記的目的蛋白（分別與抗6×His標(biāo)簽的小鼠IgG一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗結(jié)合）；C：驗(yàn)證重組蛋白與抗6×His標(biāo)簽抗體稀釋液、小鼠IgG抗體稀釋液和PBS的親和力。ns：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；****P＜0.0001。

2.2 VgrG1a蛋白免疫后小鼠血清抗體效價(jià)的檢測 在用原核系統(tǒng)表達(dá)的VgrG1a蛋白免疫BALB/c 小鼠5周后，將小鼠血清中抗體與抗原VgrG1a結(jié)合測得不同小鼠間的免疫差異（圖3）。5只小鼠編號分別為A、A34、A65、A85和A100（已排除在免疫過程中死亡的1只）。觀察在1∶640000 處稀釋倍數(shù)時，編號為A85、A65和A的小鼠血清中抗體的親和力仍較高，提示為免疫成功。

圖3 VgrG1a蛋白免疫小鼠5周后血清抗VgrG1a 蛋白抗體滴度陰性對照為同品系未免疫小鼠血清或小鼠IgG。

2.3 抗VgrG1a蛋白的鼠源單抗的制備和篩選 分別在96孔板和24孔板中進(jìn)行ELISA篩選，同一種孔板篩選2次，共4次（圖4 A、4 C）。經(jīng)篩選從1040株雜交瘤細(xì)胞中篩選出91個細(xì)胞，再將這91個細(xì)胞從96孔板轉(zhuǎn)移到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，取上清測親和力，最后選出12個長勢較好且親和力較高的細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆，并挑選出4個生長良好且為單克隆的細(xì)胞3D2C9、6D9E10、6G2D9和8A4F5（圖4 B、4 D）。

圖4 兩次96孔板和兩次24孔板的ELISA篩選結(jié)果A：第1次96孔板篩選的1040株細(xì)胞ELISA結(jié)果；B：根據(jù)第1次96孔板的ELISA篩選結(jié)果，從1040株細(xì)胞中挑選出親和力較高的23株細(xì)胞到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，取其上清再次進(jìn)行ELISA檢測圖；C：第2次96孔板的ELISA結(jié)果；D：根據(jù)第2次96孔板的ELISA篩選結(jié)果，挑選出親和力較高的68株細(xì)胞到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，取其上清再次進(jìn)行ELISA檢測。陽性對照為1:500稀釋的小鼠血清。

2.4 抗VgrG1a蛋白的鼠源抗體的SDS-PAGE檢測和ELISA親和力比較 將4種抗體（3D2C9、8A4F5、6G2D9和2G5F10）分 別 進(jìn) 行SDS-PAGE電泳分析，其中3D2C9、6G2D9和2G5F10在相對分子質(zhì)量為55000處有1條明顯的重鏈，在相對分子質(zhì)量約為30000左右有2條輕鏈，推測可能為輕鏈糖基化修飾后形成了2條帶。8A4F5抗體在相對分子質(zhì)量約為30000處有1條明顯的輕鏈，在相對分子質(zhì)量為55000左右有1條較粗的重鏈，推測可能為重鏈被修飾后的結(jié)果（圖5A）。通過非還原電泳分析后，4種抗體在大于相對分子質(zhì)量為130000處均為一條明顯條帶，提示抗體結(jié)構(gòu)完整（圖5 B）。

圖5 觀察4種抗體的還原性和非還原性SDS-PAGE電泳A：泳道1～4分別為6G2D9、2G5F10、8A4F5和3D2C9抗體進(jìn)行還原性電泳，上樣量為每孔10 μg，樣品含DTT并且95℃煮沸10 min； B：泳道5～8分別為6G2D9、8A4F5、3D2C9和2G5F10抗體非變性非還原電泳（5%濃縮膠，6%分離膠），不含DTT，未煮沸。

再分別將4種蛋白［VgrG1a、銅綠假單胞菌V抗原（PcrV）、金黃色葡萄球菌γ-溶血素A（HlgA）、金黃色葡萄球菌α-溶血素突變毒素（H35L）］包被在同一塊96孔酶標(biāo)板上，通過對比4種抗體與其他蛋白的親和力，檢測抗體對于VgrG1a蛋白的特異性親和力。PcrV、HlgA、H35L均為本實(shí)驗(yàn)室自行制備的蛋白。經(jīng)驗(yàn)證，除3D2C9外，其 余3種 抗 體2G5F10、6G2D9和8A4F5均與VgrG1a蛋白特異性結(jié)合（圖6）。將抗體送公司測序得到抗體重鏈和輕鏈的氨基酸序列信息，因8A4F5抗體與VgrG1a的親和力較高且測序結(jié)果顯示為單克隆，所以選擇8A4F5抗體進(jìn)行人源化（2G5F10、6G2D9和8A4F5的平衡解離常數(shù)分別為2.024×10－10、2.935×10－10和1.696× 10－10mol/L）。

圖6 4種抗VgrG1a蛋白抗體的親和力比較A～D: 6G2D9、3D2C9、8A4F5和2G5F10分別與VgrG1a、PcrV、HlgA、H35L蛋白的親和力；E：2G5F10, 6G2D9, 3D2C9和8A4F5分別與VgrG1a蛋白的親和力比較。將VgrG1a、PcrV、HlgA、H35L蛋白分別稀釋到1 μg/mL包被96孔板，4種抗體用PBS稀釋后作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗。

2.5 抗VgrG1a蛋白的人鼠嵌合型單抗的制備及鼠源單抗和人鼠嵌合型單抗的比較 用Expi293細(xì)胞表達(dá)人鼠嵌合型單抗8A4F5后，SDS-PAGE顯示出分布清晰2條帶：相對分子質(zhì)量為55000處為重鏈，相對分子質(zhì)量為30000處為輕鏈（圖7 A）。在同一塊96孔板分別檢測人鼠嵌合型和鼠源性2種抗體倍比稀釋后對于VgrG1a抗原的親和力，結(jié)果顯示人鼠嵌合型8A4F5抗體與抗原VgrG1a親和力較高，半人源化成功（圖7 B）。

圖7 人鼠嵌合型單抗的制備和比較A：抗VgrG1a蛋白的人鼠嵌合型單抗的SDS-PAGE檢測，每孔上樣量為10 μg；B：抗VgrG1a蛋白的人鼠嵌合型單抗與鼠源性單抗的比較。

3 討論

銅綠假單胞菌存在多個分泌系統(tǒng)［18］，其中研究比較多的是T3SS，目前已有制藥公司研發(fā)了針對T3SS針頭PcrV結(jié)構(gòu)蛋白的單抗，并且在臨床試驗(yàn)中取得了較好的效果［19-20］。T6SS是最近幾年研究較多的分泌系統(tǒng)，廣泛存在于許多革蘭陰性菌中，在細(xì)菌間競爭、抗真菌等微生物生態(tài)系統(tǒng)或金屬離子等攝取中發(fā)揮著重要作用［21-22］。T6SS由13個保守結(jié)構(gòu)組成，多由H1-T6SS基因簇編碼。VgrG1a蛋白為銅綠假單胞菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)蛋白，位于注射器的針頭部位，通過刺入靶細(xì)胞的細(xì)胞膜，到達(dá)細(xì)胞周質(zhì)，發(fā)揮遞送效應(yīng)蛋白的作 用［23］。VgrG1a不含擴(kuò)展的功能結(jié)構(gòu)域PAAR，與VgrG1b和VgrG1c三者同屬于經(jīng)典VgrGs［24］。在銅綠假單胞菌培養(yǎng)上清中常能檢測到此蛋白，所以VgrGs也被當(dāng)做銅綠假單胞菌的特征性蛋白。VgrG1a多以三聚體的形式存在，也可檢測到部分單體形式，故推測此蛋白穩(wěn)定性可能較差［25］。

VgrG1蛋白是Ⅵ型分泌系統(tǒng)的核心組件，類似于噬菌體的尾巴，與收縮裝置Hcp相連，在受到外界刺激的情況下將毒素刺入原核或真核細(xì)胞內(nèi)。不同菌種的VgrG1的大小和功能各不相同。銅綠假單胞菌的VgrG1約含643個氨基酸，大腸桿菌VgrG1約有841個氨基酸，而鮑曼不動桿菌的VgrG1含有1000多個氨基酸。霍亂弧菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)的VgrG1是一種具有肌動蛋白交聯(lián)域（ACD）的功能蛋白，通過交聯(lián)G-肌動蛋白導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排，防止被巨噬細(xì)胞吞噬［26］。在條件性致病AbCAN2型菌鮑曼不動桿菌中，既存在具有核酸酶功能的VgrG1，還存在VgrG的同源物抑制鮑曼不動桿菌T6SS的活性［27］。造成魚類敗血癥的嗜水氣單胞菌，感染豬的腸外致病大腸桿菌和植物病害相關(guān)的根癌農(nóng)桿菌中也存在依賴于T6SS的VgrG1蛋白，可見Ⅵ型分泌系統(tǒng)影響著人們生活的方方 面面。

目前，關(guān)于銅綠假單胞菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)VgrG1a蛋白在銅綠假單胞菌導(dǎo)致的人體感染中的具體作用尚不明確。最新的研究［17,28］指出，銅綠假單胞菌在菌間競爭中會表達(dá)Ⅵ型分泌系統(tǒng)，VgrG1a蛋白屬于依賴于Ⅵ型分泌系統(tǒng)分泌的眾多針頭蛋白的一員，VgrG1a蛋白攜帶的毒素Tse6被發(fā)現(xiàn)具有NAD(P)酶的作用，可通過延緩競爭菌內(nèi)能量的代謝達(dá)到抑菌作用。

本研究通過大腸桿菌原核系統(tǒng)表達(dá)帶有6×His 標(biāo)簽的VgrG1a，在通過Western印跡和ELISA實(shí)驗(yàn)分別鑒定后，得出此蛋白為實(shí)驗(yàn)所需目的蛋白。再用VgrG1a當(dāng)作抗原，免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤的融合和有限稀釋法篩選后，制備出特異度較高的鼠源性單抗，并完成了單抗的半人源化。此人鼠嵌合型單抗對VgrG1a蛋白顯示出良好的特異性和較高的親和力，為進(jìn)一步研究VgrG1a蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及其在抗銅綠假單胞菌感染中發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。