王雪春 朱影 黃常新

[摘要] 近年來(lái)，免疫檢查點(diǎn)抑制劑和嵌合抗原受體免疫療法（CAR-T）因其顯著的治療有效率，已成為某些腫瘤的“特效藥”。新抗原作為腫瘤的特異性抗原，可激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），發(fā)揮特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。目前，下一代基因測(cè)序技術(shù)和質(zhì)譜分析為新抗原的發(fā)現(xiàn)和鑒定提供了有利的技術(shù)支撐?；谛驴乖膫€(gè)性化腫瘤免疫治療的突出療效，在國(guó)內(nèi)外實(shí)體瘤治療大放異彩;其還可作為如T細(xì)胞受體修飾的T細(xì)胞治療（TCR-T）治療的特異性靶標(biāo);聯(lián)合其他抗腫瘤療法也顯示出良好的發(fā)展前景?，F(xiàn)就目前基于腫瘤新生抗原免疫治療的研究進(jìn)展做一綜述。

[關(guān)鍵詞] 腫瘤;免疫治療;腫瘤新抗原;腫瘤疫苗

[中圖分類號(hào)] R730.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）12-0188-04

[Abstract] In recent years， immune checkpoint inhibitors and chimeric antigen receptor T-cell （CAR-T） immunotherapy have become "specific drugs" for certain tumors because of their remarkable effective rate in treatment. As tumor-specific antigens， neoantigens can activate cytotoxic T lymphocytes （CTL） and exert specific anti-tumor immune responses. Currently， next-generation gene sequencing technology and mass spectrometry provide favorable technical support for the discovery and identification of neoantigens. Neoantigens-based personalized tumor immunotherapy has made a great splash in the treatment of solid tumors at home and abroad due to its outstanding efficacy. It can also serve as a specific target for T-cell receptor modified T-cell （TCR-T） therapy， for example. And the combination of it with other anti-tumor therapies has also shown a good development prospect. This paper reviews the current advances in the study of tumor neoantigens-based immunotherapy.

[Key words] Tumor; Immunotherapy; Tumor neoantigens; Tumor vaccine

據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)癌癥的新發(fā)例數(shù)和死亡例數(shù)占全球第一位[1]。近年來(lái)，以靶向藥物和免疫治療為代表的生物治療迅猛發(fā)展，超越了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療等治療，成為腫瘤治療發(fā)展的主流趨勢(shì)。目前已有大量研究證實(shí)，利用新抗原制備的腫瘤疫苗，可激發(fā)機(jī)體自身抗腫瘤免疫效應(yīng)，在腫瘤治療中具備極大的應(yīng)用前景。

1 新抗原的來(lái)源與意義

突變的發(fā)生和逐步累積被公認(rèn)為是腫瘤啟動(dòng)和進(jìn)展的主要機(jī)制，某些“非同義突變”會(huì)導(dǎo)致新抗原的產(chǎn)生[2]。新抗原是腫瘤特異性突變導(dǎo)致氨基酸序列改變形成的新表位，只存在于腫瘤組織，而不存在于正常組織，屬于腫瘤特異性抗原。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，絕大部分新抗原是來(lái)自于非編碼區(qū)突變，即蛋白翻譯后的錯(cuò)誤剪接組合和降解轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[3]，基于全外顯子或信使RNA測(cè)序預(yù)測(cè)的新抗原肽，極少為質(zhì)譜所證實(shí)。Prehn等[4]的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，引起強(qiáng)烈腫瘤排斥的抗原更具有個(gè)體特異性。因此，與腫瘤相關(guān)抗原相比，新抗原具有更強(qiáng)的免疫原性及高度特異度，能激發(fā)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)，成為精準(zhǔn)腫瘤免疫治療的特異性靶點(diǎn)。

較高的腫瘤突變負(fù)荷與改善腫瘤免疫治療的生存率有關(guān)[5]，本團(tuán)隊(duì)的前期研究還證實(shí)某些腫瘤新抗原與生存期改善有關(guān)[6-7];并且，患者預(yù)后不僅與擁有的新抗原數(shù)量相關(guān)，新抗原質(zhì)量與類型也影響著其臨床抗腫瘤免疫效應(yīng)[8-9]。

2 新抗原的發(fā)現(xiàn)與鑒定

過(guò)去常以cDNA文庫(kù)鑒定新抗原，此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力[10]。下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）因其檢測(cè)高效和技術(shù)成熟，已成為新抗原發(fā)現(xiàn)的重要手段，其簡(jiǎn)要過(guò)程如下：①利用全基因測(cè)序和（或）全外顯子基因測(cè)序等技術(shù)對(duì)患者腫瘤組織及正常組織進(jìn)行測(cè)序獲取抗原譜;②腫瘤組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄子測(cè)序;③選擇腫瘤樣品中非同義突變體;④預(yù)測(cè)與人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分子親和力;⑤體外合成抗原肽，驗(yàn)證免疫原性[11-12]。然而，目前常用的全外顯子（即編碼區(qū)）測(cè)序?qū)ふ夷[瘤新抗原肽的準(zhǔn)確性較低;并且由于每例患者的腫瘤新抗原肽不相同不通用，腫瘤細(xì)胞實(shí)際存在的免疫有效新抗原肽不多，而占絕大多數(shù)的弱免疫原性肽可導(dǎo)致免疫耐受、無(wú)能甚至免疫抑制，故需每例患者進(jìn)行體外免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)確定每條肽的免疫活性，這一過(guò)程非常費(fèi)時(shí)繁瑣。以上這些直接限制了個(gè)體化疫苗的臨床推廣應(yīng)用。因此，快速、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)有效新抗原肽和提高弱免疫原性新抗原肽的免疫效應(yīng)顯得極為重要[13]，本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，新抗原結(jié)構(gòu)特性及新抗原肽與特異性T細(xì)胞之間的關(guān)系可幫助快速發(fā)現(xiàn)和鑒定新抗原[14-15]。1F3890C3-8A7A-49C8-B0DE-876920586D0F

質(zhì)譜分析手段的成熟為新抗原鑒定提供新思路，高分辨率質(zhì)譜可直接鑒定腫瘤組織表面抗原肽。發(fā)表于Nature的研究表明，利用主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）肽組譜發(fā)現(xiàn)了95，500條與黑色素瘤相關(guān)抗原肽，并成功從中鑒定到11條體細(xì)胞來(lái)源新抗原肽[16]。質(zhì)譜鑒定抗原肽的重要條件之一是獲取MHC洗脫肽;免疫沉淀是獲取MHC洗脫肽最常用的方法之一。技術(shù)流程：①M(fèi)HC復(fù)合物通過(guò)免疫沉淀從腫瘤組織或細(xì)胞中分離;②充分洗滌除去未結(jié)合混合物;③應(yīng)用酸性洗脫液分離來(lái)自MHC分子和抗體的抗原肽;④純化肽段;⑤對(duì)純化肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析;⑥原始圖譜對(duì)比蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取真實(shí)存在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)[17-18]。此方法獲取抗原肽的特異性較高，但操作復(fù)雜。弱酸洗脫法為另一種獲取MHC洗脫肽的常用方法。利用低pH值可使MHC Ⅰ的輕鏈與 MHC Ⅰ重鏈分離，在短時(shí)間內(nèi)直接從細(xì)胞膜上洗脫MHC肽[19]。相比免疫沉淀法而言，弱酸洗脫法所獲取MHC洗脫肽假陽(yáng)性率更高。兩種方法都需要大量腫瘤組織，標(biāo)本預(yù)處理較為困難復(fù)雜，鑒定所獲取抗原肽數(shù)目龐大，影響臨床應(yīng)用。本研究團(tuán)隊(duì)目前致力于研究快速篩選基于質(zhì)譜獲取的新抗原肽方法，且頗具成效，極大縮短新抗原篩選時(shí)間。

此外，利用腫瘤共享數(shù)據(jù)庫(kù)也可快速發(fā)現(xiàn)具有免疫原性的腫瘤新抗原肽。國(guó)內(nèi)有研究者利用癌癥基因組圖譜 （the cancer genome atlas，TCGA）和癌癥體細(xì)胞突變目錄（catalogue of somatic mutations in cancer，COSMIC）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)9種常見(jiàn)的實(shí)體瘤進(jìn)行分析，在20 d內(nèi)成功鑒定出被自體外周血淋巴細(xì)胞識(shí)別的腫瘤特異性新抗原[20]。

3 基于腫瘤新抗原的抗腫瘤免疫治療

經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的免疫原性MHC結(jié)合肽可進(jìn)一步制備個(gè)性化腫瘤疫苗。國(guó)內(nèi)有研究[21]利用iNeo-Vac-P01新抗原疫苗啟動(dòng)了一項(xiàng)單臂、開(kāi)發(fā)臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示在納入的22例晚期惡性腫瘤患者中，疾病控制率為71.4%，中位無(wú)進(jìn)展生存（median progression-free survival，mPFS）為4.6個(gè)月，12個(gè)月總生存期（overall survival，OS）百分比約為55.1%，且納入的2例胰腺癌患者無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）分別為4.2個(gè)月和6.3個(gè)月，OS分別為14.0+個(gè)月和13.3+個(gè)月，高于轉(zhuǎn)移性胰腺癌一線化療方案（奧沙利鉑+伊立替康+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣，F(xiàn)OLFIRINOX）的PFS 為3.1個(gè)月，中位OS為 6.1個(gè)月[22]。

黑色素瘤具有較高的突變負(fù)荷，臨床研究結(jié)果表明個(gè)性化新抗原疫苗可以在黑色素瘤患者中刺激持久的免疫反應(yīng)，幫助控制轉(zhuǎn)移性腫瘤[23]。Ott等[24]對(duì)6例手術(shù)切除后的ⅢB/C期和ⅣM1a/b期黑色素瘤患者進(jìn)行新抗原疫苗接種，在20～32個(gè)月隨訪中，4例進(jìn)入研究的ⅢB/C期患者仍沒(méi)有復(fù)發(fā)，且2例ⅣM1b期疾病患者在接受pembrolizumab治療后得到完全緩解。

與黑色素瘤不同，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有低突變負(fù)荷和低免疫性腫瘤微環(huán)境。 然而，Keskin等[25]對(duì)手術(shù)切除和放療后的新診斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者也進(jìn)行多表位個(gè)體化新抗原疫苗接種，結(jié)果顯示循環(huán)中腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞增加，且外周血的新抗原特異性T細(xì)胞可以遷移到顱內(nèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤中，為新抗原疫苗可能改變膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的免疫環(huán)境提供依據(jù)。

研究證實(shí)，肺癌存在多種免疫逃逸機(jī)制，高克隆新抗原與肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌的無(wú)病生存率相關(guān)[26]。一項(xiàng)轉(zhuǎn)移性肺癌患者進(jìn)行單臂、多中心的新抗原疫苗臨床研究（NCT02956551）表明，對(duì)入組12例患者總共進(jìn)行85次多表位新抗原樹突狀細(xì)胞疫苗接種，盡管患者沒(méi)有達(dá)到完全緩解，但疾病客觀緩解率（objective response rate，ORR）為25%，疾病控制率達(dá)到75%，mPFS為5.5個(gè)月，中位生存期為7.9個(gè)月，且患者接受新抗原疫苗產(chǎn)生不良反應(yīng)為1～2級(jí)[27]，證實(shí)新抗原疫苗在肺癌中的有效性及安全性。國(guó)內(nèi)還有研究者利用全外顯子測(cè)序和計(jì)算機(jī)算法成功從3例非小細(xì)胞肺癌患者中篩選到強(qiáng)免疫原性新抗原，且研究者利用已從體外證實(shí)具有免疫原性的新抗原ACAD8-T105I、BCAR1-G23V 和 PLCG1-M425L對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行過(guò)繼性T細(xì)胞治療，結(jié)果提示新抗原特異性T細(xì)胞可延緩腫瘤生長(zhǎng)[28]。

4 新抗原免疫治療的聯(lián)合療法

免疫檢查點(diǎn)抑制劑通過(guò)激活宿主免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)腫瘤排斥反應(yīng)，在過(guò)去的10多年在多種癌癥中取得了極大的成功。但是，免疫檢查點(diǎn)阻斷療法單一應(yīng)用在多數(shù)患者中獲益有限[29]。一項(xiàng)基于NEO-PV-01新抗原疫苗與程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）抑制劑nivolumab聯(lián)合治療晚期黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌晚期癌癥ⅠB期研究（NCT02897765）的結(jié)果表明，三種癌癥的ORR分別為59%、39%、27%，mPFS為23.5個(gè)月、8.5個(gè)月、5.8個(gè)月，明顯優(yōu)于抗PD-1抑制劑單藥應(yīng)用臨床數(shù)據(jù)，且具備良好安全性[30-31]。

化療和靶向抗腫瘤藥物仍是臨床抗腫瘤治療的主力軍，可以導(dǎo)致免疫原性細(xì)胞死亡，啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生腫瘤特異性新抗原，增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞細(xì)胞吞噬及抗原呈遞，提高新抗原疫苗效率[32-35]。如靶向抗血管生成藥物可以重塑腫瘤血管，使其正?；?，逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化的抑制作用，恢復(fù)癌癥患者外周血樹突狀細(xì)胞數(shù)量并促進(jìn)其活化，轉(zhuǎn)化免疫抑制微環(huán)境，增強(qiáng)新抗原遞呈，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫治療[36]。

免疫治療和放療被臨床證實(shí)為很好的“搭檔”。放療可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放更多的抗原，且放療可增強(qiáng)T細(xì)胞向腫瘤組織運(yùn)輸。有研究者利用三陰乳腺癌小鼠模型發(fā)現(xiàn)，放療可增強(qiáng)免疫原性新抗原基因表達(dá)，并引發(fā)CD8+和CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致MHC -Ⅱ和死亡受體上調(diào)，此外，新抗原特異性CD8+ T細(xì)胞優(yōu)先殺死輻射的腫瘤細(xì)胞，提供新抗原與放療聯(lián)合應(yīng)用可控制腫瘤證據(jù)[37]。1F3890C3-8A7A-49C8-B0DE-876920586D0F

5 展望

目前，基于腫瘤新抗原的免疫療法雖然仍在臨床試驗(yàn)過(guò)程中，但捷報(bào)頻傳，以往“非同義突變”被認(rèn)為是新抗原主要來(lái)源。最新的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，融合基因新抗原具有更高的免疫原性，是癌癥免疫療法新興的靶標(biāo)，可作為免疫檢查點(diǎn)療效的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物[38]，受到研究者的廣泛關(guān)注。然而結(jié)合本課題組的自身實(shí)踐，抗腫瘤新抗原療法仍有許多難題尚未得到有效解決：①常見(jiàn)實(shí)體瘤驅(qū)動(dòng)基因突變產(chǎn)生的新抗原，其免疫原性較弱;②HLA等位基因型繁多，HLA限制性新抗原明確缺乏有效的預(yù)測(cè)手段，主流預(yù)測(cè)抗原與HLA親和力的數(shù)據(jù)庫(kù)，其預(yù)測(cè)效率不高，存在假陽(yáng)性;③新抗原鑒定流程復(fù)雜，亟待優(yōu)化;④新抗原治療個(gè)體性強(qiáng)，其治療成本較高，且無(wú)法普及等。而這些問(wèn)題的解決一方面需要新興檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，另一方面可能需要如生物信息學(xué)技術(shù)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、藥物設(shè)計(jì)學(xué)等學(xué)科的交叉與融入，如通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)大量HLA限制性新抗原數(shù)據(jù)，確立有效的免疫應(yīng)答位點(diǎn);結(jié)合冷凍電鏡觀察不同新抗原HLA-TCR三者復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)，明確相互作用的關(guān)系;修飾新抗原使其更容易被CTL識(shí)別并針對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答等。上述問(wèn)題的深入探討與研究將為新抗原療法臨床實(shí)踐的順利開(kāi)展提供堅(jiān)實(shí)的前期基礎(chǔ)，期待新抗原將在今后的腫瘤治療中發(fā)揮不可或缺的重要地位。

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（收稿日期：2021-10-18）1F3890C3-8A7A-49C8-B0DE-876920586D0F