何躍君 趙嚴冬 章密密 王建

[摘要] 目的 觀察下調(diào)miR-342表達或聯(lián)合赫賽汀對SKBr-3人乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能機制。方法 采用小干擾RNA技術(shù)SKBr-3細胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-342 siRNA和無義siRNA，分別加或不加赫賽汀100 μg/ml培養(yǎng)，CCK-8細胞增殖測定、凋亡實驗觀察兩組間的差異;Western blot法檢測各組細胞中HER-2蛋白的表達。結(jié)果 ①細胞增殖實驗：下調(diào)miR-342或聯(lián)合赫賽汀，miR-342 siRNA組OD值低于陰性對照組（P<0.05）;②細胞凋亡實驗：下調(diào)miR-342后48 h不增加凋亡細胞比例（P>0.05）;但聯(lián)合赫賽汀作用下，凋亡細胞比例較對照組高（P<0.05）;③RT-PCR示下調(diào)miR-342表達降低HER-2 mRNA的表達水平（P<0.05）;Western blot示miR-342 siRNA組的HER-2蛋白降低，聯(lián)合赫賽汀更顯著（P<0.05）。 結(jié)論 下調(diào)miR-342表達降低SKBr-3細胞的增殖，與赫賽汀有協(xié)同抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用，其機制可能與共同下調(diào)HER-2蛋白表達有關。

[關鍵詞] 乳腺癌;miR-342;赫賽汀;HER-2蛋白;SKBr-3細胞

[中圖分類號] R737.9? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）12-0028-03

[Abstract] Objective To observe the effects of inhibiting the expression of miR-342 or combining Herceptin on the proliferation and apoptosis of SKBr-3 breast cancer cells， and to explore its possible mechanism. Methods Small interfering RNA technology was used to transiently transform the cells with miR-342 siRNA and nonsense siRNA， with or without Herceptin 100 μg/ml treatment， and observed the difference between the two groups by cell proliferation assay and apoptosis experiment; Western blot was used to detect the expression of HER-2 protein. Results Cell proliferation assay： downregulation of miR-342 or combined with Herceptin， the OD value of miR-342 siRNA group was lower （P<0.05）; ②Apoptosis test： 48 hours after downregulating miR-342， the proportion of apoptotic cells was not increased （P>0.05）; but under the combined effect of Herceptin， the proportion of apoptotic cells in miR-342 siRNA group was higher （P<0.05）; ③RT-PCR showed down-regulation of miR-342 expression decreased the level of HER-2 mRNA （P<0.05）; Western blot showed the HER-2 protein in the miR-342 siRNA group decreased， which was more significant in combination with Herceptin （P<0.05）. Conclusion Down-regulating miR-342 expression can reduce the proliferation of SKBr-3 cells， and has a synergistic effect on inhibiting cell proliferation and promoting cell apoptosis combined with Herceptin. The mechanism may be related to the joint down-regulation of HER-2 protein expression.

[Key words] Breast cancer; miR-342; Herceptin; HER-2 protein; SKBr-3 cell

HER-2基因過表達在乳腺癌患者中發(fā)生率為15%～20%，HER-2陽性乳腺癌惡性程度高、易復發(fā)轉(zhuǎn)移，預后較差[1-2]。針對HER-2蛋白的靶向藥物曲妥珠單抗（Herceptin，赫賽汀）的臨床應用使其預后明顯改善[3-4]。但部分患者仍會出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移，可能與赫賽汀耐藥相關[5]。MicroRNA調(diào)控多種基因的表達，某些microRNA的異常表達影響腫瘤對放化療、靶向藥物的敏感性[6-7]。本課題組前期研究顯示，乳腺癌組織中的miR-342表達水平與HER-2的表達呈正相關[8]。本實驗觀察下調(diào)miR-342對SKBr-3細胞HER-2表達水平的影響，以及聯(lián)合赫賽汀是否具有協(xié)同作用，為探索HER-2陽性乳腺癌可能的新靶點提供實驗基礎，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

赫賽汀產(chǎn)自羅氏公司，SKBr-3細胞購自上海生科院細胞資源中心，miR-342、HER-2及內(nèi)參相關引物由上海生工合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時PCR試劑盒購自日本Takara公司，一抗、二抗購自美國Santa Cruz公司。ABI 7300 real-time PCR儀器（Ambion）。

1.2 RT-PCR檢測miR-342的表達

按Trizol試劑說明書抽提總RNA，為增加微小RNA獲得率，將步驟中異丙醇沉淀改成-20℃沉淀2 h以上。miR-342莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物及內(nèi)參U6的引物，miR-342：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-A GTTGAGACGGGTGC;U6snRNA：AACGCTTCACGA-ATTTGCGT?？俁NA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應條件：42℃ 60 min，85℃ 5 min。RT-PCR檢測miR-342表達，miR-342引物上游：ACACTCCAGCTGGGTTCTCACACAGAAATC，下游：TGGTGTCGTGGAGTCG;U6 sn RNA引物上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AACG-CTTCACGAATTTGCGT。反應條件：95℃，預變性10 min后，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。

1.3 HER-2 mRNA的實時定量PCR

總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保持。實時定量PCR，HER-2引物上游：GGAGACCCGCTGAACAATACC，下游：AGAGCGGTT-GGTGTCTATCAGTG;β-actin引物上游：TTCTACAATGAGCTGCGTGTG，下游：CAGCCTGGATAGCAACGTACA。反應條件：95℃預變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個循環(huán)。

1.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

SKBr-3細胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用小干擾RNA技術(shù)，將miR-342 siRNA及無義siRNA（上海吉瑪），配成2×10-5 mol/L的工作液，按lipo2000轉(zhuǎn)染劑說明書轉(zhuǎn)染。

1.5 細胞增殖檢測

CCK-8比色法檢測細胞增殖，細胞接種于96孔板中，每孔含5000個細胞，設5個平行孔，培養(yǎng)箱中24 h，加或不加含100 μg/ml赫賽汀的培養(yǎng)基，設置培養(yǎng)液對照孔。孵育48 h更換含10% CCK-8的新鮮培養(yǎng)液，溫箱孵育4 h，測450 nm處吸光度（OD）值。

1.6 細胞凋亡測定

細胞接種于6孔板中，細胞數(shù)1.5×105個/孔。溫箱中24 h，棄去原液，加或不加含100 μg/ml赫賽汀的培養(yǎng)基48 h，不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化，離心、收集細胞。凋亡試劑盒進行避光染色，室溫孵育30 min上流式細胞儀進行檢測，實驗重復3次。

1.7 Western blot檢測HER-2蛋白的表達

細胞加或不加100 μg/ml赫賽汀處理48 h，按試劑盒說明提取總蛋白，一抗加兔抗人HER-2抗體，4℃孵育過夜、洗膜3次、加羊抗兔IgG（二抗）室溫孵育2 h，洗膜3次，暗室中顯影。β-actin作內(nèi)參。Image J軟件灰度分析：計算目的蛋白與對應的內(nèi)參蛋白的灰度值比。

1.8 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。多組均數(shù)比較用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后miR-342及HER-2 mRNA表達的變化

SKBr-3細胞轉(zhuǎn)染miR-342 siRNA后miR-342相對表達量為對照組的（0.00048±0.00031）倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），下調(diào)miR-342的表達顯著;HER-2 mRNA的表達量降低為對照組的（0.75±0.09）倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 下調(diào)miR-342聯(lián)合赫賽汀對細胞增殖的影響

細胞增殖實驗，下調(diào)miR-342后48 h的OD值低于對照組（P<0.05），對細胞的增殖具有抑制作用;加赫賽汀100 μg/ml 48 h后，兩組均表現(xiàn)明顯增殖抑制作用（P<0.05）;miR-342 siRNA組的抑制作用更為顯著，OD值低于對照組（P<0.05）。見圖1。

2.3 下調(diào)miR-342聯(lián)合赫賽汀對細胞凋亡的影響

細胞凋亡實驗，下調(diào)miR-342后48 h時的凋亡細胞比例與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。但加入100 μg/ml赫賽汀作用48 h，兩組的凋亡細胞比例均較未加藥組增加（P<0.05）;其中，miR342 siRNA組的凋亡細胞比例增加更多（P<0.05）。見封三圖1。

2.4 Western blot檢測Her-2蛋白的表達

Western blot結(jié)果顯示，miR-342 siRNA組較對照組細胞中HER-2蛋白的表達水平降低（P<0.05）;加入100 μg/ml的赫賽汀48 h后HER-2蛋白的表達水平均降低，其中miR-342 siRNA組降低更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見封三圖2。

3 討論

HER-2陽性乳腺癌惡性程度高，易復發(fā)轉(zhuǎn)移，靶向藥物赫賽汀可降低其50%的復發(fā)率，同時延長無進展生存期[2，9]?？墒菃斡煤召愅〉挠行蕿?2%～34%，中位緩解期約9個月，有66%～88%的患者在接受赫賽汀治療1年內(nèi)即產(chǎn)生耐藥，導致腫瘤進展[10]。

赫賽汀耐藥可能與HER-2基因擴增及蛋白高表達、HER-2結(jié)合位點受損、HER-2下游通路激活、HER家族成員間的相互作用有關[11-12]。既往已有關于HER-2蛋白表達與赫賽汀耐藥的研究，其中一項研究通過對轉(zhuǎn)移性HER-2陽性乳腺癌患者的HER-2蛋白表達定量檢測發(fā)現(xiàn)，HER-2低表達（H2T<16.1 RF/mm2）患者的PFS比中度表達（16.1 RF/mm2≤H2T≤68.3 RF/mm2）患者顯著延長;而HER-2高表達（H2T>68.3 RF/mm2）患者的PFS比中度表達者縮短5～6倍，結(jié)果顯示HER-2蛋白高表達影響赫賽汀的療效[13]。另一項Ⅲ期臨床研究檢測455例HER-2陽性乳腺癌患者的HER-2蛋白表達，結(jié)果顯示赫賽汀聯(lián)合拉帕替尼治療組中HER-2蛋白高表達者的pCR及PFS均優(yōu)于低表達者[14]。因此，目前關于HER-2蛋白表達量對赫賽汀療效影響的研究結(jié)果并不統(tǒng)一。

microRNA參與調(diào)控多種靶基因的mRNA，廣泛參與腫瘤的多重耐藥，包括化療藥物、內(nèi)分泌及靶向藥物[15]。近年來microRNA在逆轉(zhuǎn)藥物耐藥性及調(diào)節(jié)腫瘤藥物敏感性的研究備受關注。本實驗瞬時轉(zhuǎn)染示下調(diào)miR-342后，細胞中HER-2 mRNA及HER-2蛋白的表達水平也相應降低;下調(diào)miR-342聯(lián)合赫賽汀有協(xié)同抑制細胞增殖的作用;赫賽汀可以增強免疫細胞攻擊作用，誘使免疫細胞殺傷腫瘤靶細胞并促進其凋亡[16]。細胞凋亡檢測示，下調(diào)miR-342表達后48 h未見對細胞凋亡比例的影響，但與赫賽汀聯(lián)合時發(fā)揮協(xié)同作用可促進細胞凋亡。

Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，針對HER3 mRNA或miR-125a/b的聯(lián)合靶向治療可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌曲妥珠單抗的耐藥。本實驗下調(diào)miR-342的表達與赫賽汀聯(lián)用，能顯著抑制SKBr-3細胞HER-2蛋白的表達水平，表明二者可能是通過共同下調(diào)HER-2蛋白的表達來協(xié)同抑制細胞增殖、促進凋亡。miR-342是否能通過改變HER-2表達或直接作用來調(diào)節(jié)HER家族其它成員的表達，從而影響赫賽汀的藥物敏感性，需要進一步研究。

綜上所述，本實驗初步證實HER-2陽性乳腺癌細胞下調(diào)miR-342聯(lián)合赫賽汀有協(xié)同抑制腫瘤增殖、促進細胞凋亡的作用，可能與共同下調(diào)HER-2蛋白表達有關。為HER-2陽性乳腺癌的治療提供新靶點可能，也為后續(xù)進一步研究提供實驗基礎。

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（收稿日期：2021-08-04）