李幸旻

廣州市中新廣州知識城醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510363

肺結(jié)核是由感染結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性、傳染性疾病，結(jié)核桿菌會(huì)入侵機(jī)體肺部、肝部、胃部、腸部等各個(gè)器官組織，其中最為常見的為肺結(jié)核。臨床數(shù)據(jù)顯示，近年來臨床肺結(jié)核發(fā)病率表現(xiàn)出明顯升高趨勢，青年人為高發(fā)群體，有4～8 周的潛伏期，隨著病程進(jìn)展，還會(huì)累及腸、腦膜、皮膚等。肺結(jié)核表現(xiàn)為慢性過程，多數(shù)存在咳嗽、低熱、乏力、呼吸系統(tǒng)等癥狀，但不同肺結(jié)核其臨床癥狀存在一定差異[1]。肺結(jié)核患者一旦治療不及時(shí)，將對機(jī)體各個(gè)器官組織造成嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)而危及生命。因此，臨床需及早發(fā)現(xiàn)、診斷疾病，及時(shí)開展治療，對提高疾病預(yù)后具有積極的作用。以往臨床診斷肺結(jié)核多采取抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)等手段，但抗酸染色檢出率相對低，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)用時(shí)長，檢測樣本容易被污染，導(dǎo)致部分肺結(jié)核患者未被及時(shí)檢出，影響疾病治愈率，并增加了傳染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，臨床需尋求一種快速、準(zhǔn)確的診斷方法。結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測 （GeneXpertMycobacterium tuberculosis/Rifampin，GeneXpert MTB/RIF）技術(shù)是一種新型的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）檢測技術(shù)，可對MTB 的rpoB 基因突變性進(jìn)行檢測，且操作簡單，用時(shí)少，現(xiàn)在臨床得到廣泛應(yīng)用[2]。本研究選取疑似肺結(jié)核患者研究對象，著重評估GeneXpert MTB/RIF技術(shù)、抗酸染色檢測的臨床診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年10月至2021年10月中新廣州知識城醫(yī)院收治的80 例疑似肺結(jié)核患者作為研究對象。男48 例，女32 例；年齡25～59 歲，平均（44.56±3.33）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有發(fā)熱、咳嗽、咳痰、胸痛、盜汗等伴隨癥狀；②患者語言功能障礙，對研究可配合；③臨床資料可靠、真實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他呼吸系統(tǒng)疾病；②妊娠和哺乳特殊階段女性；③并發(fā)肝腎功能不健全或嚴(yán)重?fù)p傷；④患者意識缺失、精神嚴(yán)重障礙，對檢查及研究無法配合；⑤并發(fā)血液系統(tǒng)疾病。本研究患者及家屬均充分知情，高度配合，且研究已征得醫(yī)院理論委員會(huì)核準(zhǔn)。

1.2 方法

患者均接受Gene Xpert MTB/RIF 診斷、抗酸染色診斷。

Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)：應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑[上海仁度生物科技有限公司，國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2011 第3401033 號]，美國ABI 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀stepone（上海艾研生物科技有限公司）、結(jié)核桿菌熒光定量PCR 診斷試劑盒[成都永安制藥有限公司，國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2009 第3400558 號]，應(yīng)用Gene Xpert 全自動(dòng)熒光定量PCR 工作站，最少對1 ml 1 個(gè)菌進(jìn)行檢測。采集患者痰液樣本1 ml，加入處理液2 ml，漩渦震蕩10 s，孵育時(shí)間10 s，再次進(jìn)行震蕩，孵育5 min，應(yīng)用新的移管液，取處理后樣本2 ml置入試劑匣中，置入樣本位置，實(shí)施Gene Xpert MTB/RIF 檢測?？刂芇CR檢測環(huán)境：95℃15 min；35 循環(huán)（95℃20 s，60℃40 s，72℃40 s），72℃30 min。反應(yīng)體系：Taq 酶2 μl PCR 緩沖液；PCR 引物20 pmol；dNIPs 2.5 pmol/L；氯化鎂溶液25 mmol/L。陽性結(jié)果分為高（Ct<16）、中（16≤Ct<22）、低（Ct：22≤Ct≤28）、極低（Ct>28）。

抗酸染色：以《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[3]為參考，實(shí)施檢驗(yàn)，患者痰液樣本3～5 ml，取痰標(biāo)本于干燥玻片上，干燥后進(jìn)行加熱固定，應(yīng)用石碳酸復(fù)紅染液染色處理，脫色后加入亞甲藍(lán)復(fù)染，鏡片干燥。

1.3 觀察指標(biāo)

①分析兩種檢測方式的檢測結(jié)果?？顾崛旧嚎顾峒?xì)菌在染色后，對3%鹽酸乙醇的脫色作用抵抗而繼續(xù)維持紅色則判定陽性；非抗酸細(xì)菌染色后，經(jīng)3%鹽酸乙醇的脫色而復(fù)染為藍(lán)色判定為陰性。Gene Xpert MTB/RIF 診斷：根據(jù)儀器檢測結(jié)果判定[4]。②比較兩種檢測方式的陽性率。陽性率=陽性檢出數(shù)/總例數(shù)×100%。③比較不同檢測方法的診斷準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度。靈敏度：真陽性/（真陽性+假陰性）×100%；特異度：真陰性/（假陽性+真陰性）×100%；準(zhǔn)確度：（真陽性+真陰性）/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測方式的診斷結(jié)果

80 例疑似結(jié)核病患者經(jīng)臨床病理診斷確診42例，Gene Xpert MTB/RIF 檢測的陽性率為47.50%，高于抗酸染色的陽性率17.50%（表1）。

表1 兩種檢測方式的診斷結(jié)果（例）

2.2 兩種檢測方式的診斷效能

Gene Xpert MTB/RIF 檢測的診斷靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為90.48%、100.00%、95.00%，抗酸染色的診斷靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為33.33%、100.00%、65.00%，Gene Xpert MTB/RIF 檢測的診斷靈敏度、準(zhǔn)確度高于抗酸染色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 兩種檢測方式的診斷效能[%（n/N）]

3 討論

肺結(jié)核指結(jié)核桿菌感染所致的疾病，是臨床常見且可致命的傳染病，其病原菌為結(jié)核分枝桿菌，主要是人型、牛型，其中，人型結(jié)核桿菌感染發(fā)病率相對更高[5]。結(jié)核桿菌通常感染并破壞肺、淋巴結(jié)系統(tǒng)等，但是，其他器官組織亦可受感染，如腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及骨骼和循環(huán)系統(tǒng)。該病多數(shù)為慢性過程，極少數(shù)為急性發(fā)病，往往伴有咳嗽、低熱、乏力以及體力下降等多種癥狀。通常情況下，肺結(jié)核主要是經(jīng)呼吸道進(jìn)行傳染，同時(shí)也可經(jīng)消化道感染，僅有少數(shù)患者經(jīng)皮膚傷口感染，肺結(jié)核患者從呼吸道排出大量帶菌微滴，若吸入帶菌微滴即可造成感染[6]。到達(dá)肺泡的結(jié)核桿菌會(huì)趨化和吸引巨噬細(xì)胞，且被巨噬細(xì)胞吞噬，在有效細(xì)胞免疫建立之前，因巨噬細(xì)胞對結(jié)核桿菌殺滅能力存在限制，就會(huì)導(dǎo)致結(jié)核桿菌在細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，從而引起局部炎癥，或者發(fā)生全身性血源性播散，成為肺結(jié)核發(fā)生的根源與基礎(chǔ)。肺結(jié)核患者如未及時(shí)開展治療，可對患者及家庭帶來嚴(yán)重影響，甚至還可發(fā)生大范圍傳播，造成嚴(yán)峻的社會(huì)負(fù)擔(dān)[7]。近年來，伴隨抗結(jié)核藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致耐藥性肺結(jié)核患病人數(shù)隨之增加，臨床治療難度增加[8]。因此，肺結(jié)核患者早期診斷、及時(shí)治療，對增強(qiáng)臨床療效、提高患者預(yù)后具有積極的意義。

在臨床診斷中，抗酸染色、分離培養(yǎng)法是常用的結(jié)核分枝桿菌檢測技術(shù)，但診斷準(zhǔn)確性不高，快速核酸檢測技術(shù)的應(yīng)用，極大程度上提高臨床結(jié)核分枝桿菌診斷效率?？顾崛旧ㄔ诮Y(jié)核分枝桿菌數(shù)目較低時(shí)可能在鏡檢時(shí)無法找到，對中量級結(jié)核分枝桿菌標(biāo)本，一旦樣本處理不慎或采集樣本質(zhì)量不佳，實(shí)施抗酸染色法發(fā)生漏診概率較高[9-10]。Gene Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)是一種高度自動(dòng)化檢測方法，在檢測時(shí)可自動(dòng)檢測所采集到的樣本，用時(shí)較短，通常僅需2 h 即可得到檢測結(jié)果，從而大大提高臨床結(jié)核分支桿菌診斷效率[11]。同時(shí)Gene Xpert MTB/RIF 檢測技術(shù)診斷價(jià)值較高，在診斷過程中可對單個(gè)拷貝的核酸進(jìn)行檢測，故敏感度較高，而在檢測中不會(huì)出現(xiàn)氣溶膠問題，檢測環(huán)境要求維持在15～30℃，在高濕度環(huán)境中也開展檢測，具有操作簡單、用時(shí)較短、準(zhǔn)確率高等突出優(yōu)勢，相較抗酸染色檢測法，可有效節(jié)省診斷時(shí)間，從而為臨床醫(yī)生病原學(xué)診斷及治療方案制定提供可靠參考，以便疾病及早得到控制，避免大范圍傳播[12-13]。本研究結(jié)果顯示，80 例疑似肺結(jié)核患者經(jīng)臨床病理診斷確診42 例，GeneXpert MTB/RIFF 檢測陽性率47.50%高于抗酸染色陽性率17.50%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GeneXpert MTB/RIF 檢測診斷靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為90.48%、100.00%、95.00%，抗酸染色的診斷靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為33.33%、100.00%、65.00%，GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)診斷靈敏度、準(zhǔn)確度高于抗酸染色結(jié)果。相較于抗酸染色檢測法，應(yīng)用GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)對肺結(jié)核陽性檢出率、靈敏度、準(zhǔn)確度均更高，診斷價(jià)值顯著。分析如下，在MTB/RIF 核酸檢測過程，主要利用Gene Xpert 檢測系統(tǒng)實(shí)施半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR 體外診斷，靶基因是rpoB 基因，可將DNA 自動(dòng)提取并完成rpoB基因192 bp 片段的擴(kuò)增后檢測，在檢測中應(yīng)用3 種特異引物和6 種分子信標(biāo)，6 種探針同時(shí)檢測，還可對利福平耐藥性自動(dòng)檢測[14-16]。但需注意，Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)檢測價(jià)格相對較高，故在臨床廣泛應(yīng)用及普及方面存在一定局限性，且無法對非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測，無法對死菌與活菌有效區(qū)分，在檢測中僅可對一種藥物耐藥基因進(jìn)行檢測，而在檢測時(shí)部分特殊的利福平耐藥相關(guān)基因突變會(huì)對檢測結(jié)果造成影響[17-18]。

綜上所述，在肺結(jié)核診斷中應(yīng)用Gene Xpert MTB/RIF 技術(shù)，相較于抗酸染色檢測，具有較高的診斷準(zhǔn)確率及靈敏度，且操作方便，可對肺結(jié)核診斷方案予以優(yōu)化，為后期治療工作開展提供可靠的依據(jù)，實(shí)現(xiàn)顯著的診斷價(jià)值。