洪秋語 伍亞男▲ 招浩熙 萬信良

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，貴州貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550002

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是目前導(dǎo)致患者殘疾和死亡的重要原因之一[1]?；謴?fù)冠脈灌注是其治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的基本原則，其中最主要的治療手段是溶栓再通和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療[2]。然而研究顯示，這些再灌注治療手段可能會進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷和功能障礙，這一病理過程稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）[3]。MIRI 的發(fā)生發(fā)展涉及氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)和鈣超載等[4-5]。由于MIRI 的病理機制復(fù)雜，且尚無有效的治療方案。因此，針對MIRI 的發(fā)病機制進(jìn)行探索和預(yù)防治療具有重要意義。

在中醫(yī)理論中，MIRI 可歸屬于“胸痹”“心痛”等范疇，其病機多以瘀血內(nèi)阻、心氣不足為關(guān)鍵，故針對MIRI 宜采用活血散瘀、補益心氣之法[6]。桃仁紅花煎出自《陳素庵婦科補解》卷一，由桃仁、紅花、丹參、香附、延胡索、乳香、青皮、赤芍、川芎、當(dāng)歸以及生地黃11 味中藥材組成，該方具有理血行氣、化瘀止痛之效，主治心脈痹阻證[7-9]。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究及實踐中，桃仁紅花煎針對缺血所致的心肌損害疾病可發(fā)揮良好的治療效果[7-9]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)，預(yù)測并分析桃仁紅花煎的成分、靶點及信號通路，進(jìn)一步探討治療MIRI 的新思路。

1 資料與方法

1.1 桃仁紅花煎的活性成分及其靶點的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（pharmacology database and analysis platform of traditional Chinese medicine system，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18為篩選條件，檢索出桃仁、紅花、丹參、香附、延胡索、乳香、青皮、赤芍、川芎、當(dāng)歸的活性成分和靶點；并通過中藥分子機制的生物信息學(xué)分析工具（bioinformatics tool for molecular mechanism analysis of traditional Chinese medicine，BATMAN -TCM，http://lib.cpu.edu.cn/92/7a/c1175a103034/page.htm），以閾值>55、P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得生地黃的活性成分和靶點。

同時，通過中國知網(wǎng)、萬方、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫和維普數(shù)據(jù)庫，對桃仁紅花煎藥物進(jìn)行檢索，將其中對MIRI 有明確治療作用的化合物補充納入為活性成分。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫，對已篩選的靶點進(jìn)行統(tǒng)一化處理，從而轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因名稱。

1.2 MIRI 靶點收集

在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫中，以“myocardial reperfusion injury”和“myocardial ischemia reperfusion injury”為檢索詞，篩選出并獲取MIRI 疾病靶點。

1.3 交集靶點匯總及韋恩圖制作

通過桃仁紅花煎的潛在治療靶點與MIRI 疾病靶點進(jìn)行交集匯總，得出共同靶點。1

.4 桃仁紅花煎的活性成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

對桃仁紅花煎的藥物和靶點用編號進(jìn)行統(tǒng)一處理：藥物采用大寫首字母為編號，如丹參”的編號為“DS”；唯一成分采用藥物大寫首字母加數(shù)字的形式為編號，如YHS1 等；共有成分則以A1 等作為編號。

將整理的數(shù)據(jù)導(dǎo)入至Cytoscape 3.8.2 軟件，繪制出桃仁紅花煎“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將共同靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治?，使用Cytoscape 3.8.2 軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化處理，制作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein-protein interaction networks，PPI）。

1.6 基因本體分析和京都基因與基因組百科全書分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對桃仁紅花煎治療MIRI 的靶點進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG），物種設(shè)定為“Homo sapiens”。根據(jù)數(shù)據(jù)庫的富集分析，選取P值前10 位的結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.7 分子對接

選取前5 個核心靶點及核心成分，從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫與PubChem 數(shù)據(jù)庫中分別下載核心靶點與核心成分的結(jié)構(gòu)。將結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入PyMol 2.5.2 及AutoDockTools 1.5.6 軟件進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 桃仁紅花煎的活性成分及其靶點的結(jié)果

初步篩選出桃仁紅花煎的活性成分，并補充文獻(xiàn)檢索所得的結(jié)果，最終收集到存在靶點的活性成分201 個，其中有35 個為共有活性成分，收集到靶點3170 個。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫對靶點進(jìn)行注釋并去重，得到303 個潛在治療靶點基因。

2.2 MIRI 靶點整合

整合數(shù)據(jù)庫的結(jié)果，共獲取527 個MIRI 疾病靶點。

2.3 桃仁紅花煎治療MIRI 靶點韋恩圖制作

將活性成分靶點與疾病靶點進(jìn)行交集分析，獲得86 個桃仁紅花煎治療MIRI 共同靶點。

2.4 桃仁紅花煎的活性成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運用Cytoscape 3.8.2 軟件，繪制出桃仁紅花煎“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)并獲取桃仁紅花煎治療MIRI的關(guān)鍵成分，見圖1 及表1。

圖1 “活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，得到86個節(jié)點與1235 條邊，繪制出桃仁紅花煎成分-MIRI 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

圖3 GO 富集分析

圖2 桃仁紅花煎成分-MIRI 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO 和KEGG 富集分析

結(jié)果顯示，在GO 富集分析中，共預(yù)測到了381個條目，生物過程中富集最高的是凋亡過程的負(fù)調(diào)控，細(xì)胞組成富集最高的是細(xì)胞外間隙，分子功能富集最高的是酶結(jié)合，見圖4。

圖4 KEGG 分析

KEGG 富集分析的結(jié)果顯示桃仁紅花煎治療MIRI 的信號通路共114 條，其中核心通路為腫瘤壞死因子信號通路（tumor necrosis factor，TNF）與缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1 signaling pathway，HIF-1）信號通路，見圖5。

2.7 分子對接

根據(jù)自由能（affinity）對分子對接結(jié)果進(jìn)行評估，自由能越小，提示受體與配體親和力越強。結(jié)果顯示，核心成分與核心靶點對接結(jié)果均小于-5 kcal/mol。其中，植物甾醇和TNF 的結(jié)合自由能為-9.7 kcal/mol，槲皮素和絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）的結(jié)合自能為-9.4 kcal/mol，木犀草素和TNF 的結(jié)合自由能為-9.1 kcal/mol。這些成分及靶點自由能較高，可能具有較強的親和性。

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，預(yù)測得出桃仁紅花煎的主要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素。其中，槲皮素通過上調(diào)沉默信息調(diào)控因子1 的表達(dá)，發(fā)揮對MIRI 的保護(hù)作用[10]。β-谷甾醇通過參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和凋亡途徑抑制MIRI 所致的心肌細(xì)胞損傷[11]。木犀草素預(yù)處理減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，抑制MIRI 導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡[12]。以上結(jié)果顯示桃仁紅花煎的主要活性成分能一定程度上發(fā)揮抗MIRI 作用。

本研究結(jié)果顯示，蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1）、白介素6（interleukin-6，IL-6）、TNF 等靶點可能在桃仁紅花煎治療MIRI 中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。AKT1具有調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的功能，能夠減輕缺血-再灌注損傷所致的心肌損傷[13]。在MIRI 進(jìn)程中，促炎因子IL-6、TNF 血清含量的降低，有利于減輕心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而減少心肌梗死面積[14]。丹參可下調(diào)AKT1，調(diào)控血小板活性，發(fā)揮拮抗MIRI 的作用[15]。紅花活性成分可降低MIRI 大鼠血清中IL-6、TNF-α 的含量，達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[16]。以上研究一定程度上證明了桃仁紅花煎的主要藥物如丹參、紅花等可以調(diào)節(jié)重要的核心靶點治療MIRI。

分子對接結(jié)果顯示，桃仁紅花煎的核心成分與核心靶點均有較好的親和力，進(jìn)一步驗證了上述活性成分及靶點預(yù)測。

KEGG 結(jié)果，顯示桃仁紅花煎治療MIRI 的主要通路可能為TNF 信號通路與HIF-1 信號通路。研究顯示，TNF 信號通路的上調(diào)會導(dǎo)致下游靶點核因子-κB 水平的升高，進(jìn)一步加劇MIRI[17]。HIF-1 信號通路可通過抑制Toll 樣受體4 信號通路的表達(dá)，減輕MIRI 大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)[18]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，桃仁紅花煎能抑制大鼠的IL-6和TNF-α 表達(dá)水平，進(jìn)而達(dá)到抗動脈粥樣硬化作用[19]。桃仁紅花煎能顯著抑制大鼠血小板聚集，并具有改善血液流變學(xué)的作用[20]。MIRI 的發(fā)生與動脈粥樣硬化等心血管疾病以及血小板聚集、血液流變學(xué)異常等病理狀態(tài)具有密切的關(guān)系。同時上述實驗[19-20]所提及的作用靶點，與本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究預(yù)測結(jié)果具有一定的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測發(fā)現(xiàn)桃仁紅花煎可能通過多成分、多靶點以及多通路治療MIRI，同時分子對接結(jié)果顯示桃仁紅花煎活性核心成分與靶點具有良好的結(jié)合性，進(jìn)一步驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果。桃仁紅花煎原本用于婦科病的治療，然而經(jīng)過近現(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)，桃仁紅花煎對于心肌缺血類疾病具有良好的治療效果。本研究通過對數(shù)據(jù)可視化處理分析，預(yù)測出桃仁紅花煎干預(yù)MIRI 的復(fù)雜過程。臨床實踐與生物信息技術(shù)預(yù)測的結(jié)果不僅體現(xiàn)了中醫(yī)“異病同治”的治則，更為進(jìn)一步的動物實驗研究提供理論參考。