郭子琳，夏聰敏，唐曉頗?

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種慢性自身免疫病，患者體內(nèi)產(chǎn)生異常的自身抗體、補(bǔ)體和免疫復(fù)合物［1-2］，常攻擊多器官、多系統(tǒng)［3］。SLE 在我國患病率達(dá)30～70/10 萬［4］，其發(fā)病機(jī)制尚無定論，臨床癥狀復(fù)雜多樣，病勢(shì)遷延，威脅著眾多育齡期女性［5-6］。糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑是臨床常用藥［7］，但由于遠(yuǎn)期療效及安全性欠佳、價(jià)格昂貴等問題，本病治療始終存在瓶頸［8］。

中醫(yī)對(duì)SLE 的認(rèn)識(shí)歷史悠久，《內(nèi)經(jīng)》云：“風(fēng)雨寒熱不得虛，邪不能獨(dú)傷人。此必因虛邪之風(fēng)……乃客其形”，點(diǎn)明其發(fā)病核心在于本虛；《金匱要略》專篇首次以“陰陽毒”命名，認(rèn)為病機(jī)屬虛實(shí)夾雜，邪盛正虛貫穿始終［9］。近年來，中醫(yī)藥治療SLE 嶄露頭角，在增效減毒、調(diào)節(jié)免疫、控制疾病活動(dòng)、促進(jìn)激素撤減等方面優(yōu)勢(shì)突出［10］。白芍作為風(fēng)濕免疫科常用中藥，臨床療效確切［11-12］，不僅能明顯改善SLE 患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，降低血清免疫因子水平［13-14］，還能控制疾病活動(dòng)，激活低表達(dá)免疫細(xì)胞［15］。但其發(fā)揮作用的具體物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制尚待闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在疾病－靶點(diǎn)－藥物的多層次網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上研究起效機(jī)制，與中醫(yī)整體觀念相呼應(yīng)，應(yīng)用十分廣泛［16-17］。本研究借助此方法，挖掘白芍治療SLE的深層機(jī)制，探討其科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 白芍活性成分篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

基于TCMSP平臺(tái)［18］（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索并篩選出口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18［19］的白芍活性成分，結(jié)合文獻(xiàn)補(bǔ)充完善篩選結(jié)果。從PubChem［20］（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫查找對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化 SMILES 格式導(dǎo)入SwissTargetPrediction［21］（http：//www.swisstargetprediction.ch/）平臺(tái)，得到活性成分對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)，與TCMSP所預(yù)測(cè)靶標(biāo)匯總?cè)ブ睾?，利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 白芍“活性成分－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.2［22］軟件將上述結(jié)果構(gòu)建為“白芍－活性成分－潛在靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖，其中藥物、活性成分、潛在靶標(biāo)以“節(jié)點(diǎn)”（node）表示，三者關(guān)聯(lián)情況由“邊”（edge）呈現(xiàn)。

1.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)確定

以“systemic lupus erythematosus”為關(guān)鍵詞，從TTD［23］、OMIM［24］、GeneCards［25］、DrugBank［26］、CTD［27］等數(shù)據(jù)庫檢索、篩選疾病靶點(diǎn)，去重后導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫實(shí)現(xiàn)基因標(biāo)準(zhǔn)化，獲得SLE 相關(guān)靶點(diǎn)，再通過Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）平臺(tái)提取出白芍和SLE的交集靶點(diǎn)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將白芍與SLE 相關(guān)靶點(diǎn)分別導(dǎo)入BisoGenet 插件中，得到各自的蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，利用Merge 功能獲取二者交集部分，結(jié)合拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA［28］及相關(guān)研究文獻(xiàn)，將交集網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的屬性值逐一進(jìn)行分析。算出連接度的中位數(shù)并提取所有大于其2 倍值的節(jié)點(diǎn)，得到“Hit hubs”網(wǎng)絡(luò)。接著提取所有大于連接度（degree centrality，DC）2 倍中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，以及所有大于緊密度（closeness centrality，CC）、介度（betweenness centrality，BC）、特征向量（eigenvector centrality，EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）和局部邊連通性（local average connectivity，LAC）中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，作為核心靶點(diǎn)。

1.5 通路富集分析

數(shù)量龐大的基因、蛋白生物功能注釋信息都可通過檢索DAVID 數(shù)據(jù)庫［29］（https：//david.ncifcrf.gov/）獲得。將白芍與SLE 的共同靶點(diǎn)錄入DAVID 數(shù)據(jù)庫，勾選GO 插件中的生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）選項(xiàng)，以及Pathway插件中的KEGG 選項(xiàng)，完成富集分析。提取GO 中P值＜0.1、KEGG 中P值＜0.05 的結(jié)果，經(jīng)微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）平臺(tái)繪制氣泡圖，P值展示為節(jié)點(diǎn)顏色變化，氣泡大小表示基因數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 白芍活性成分篩選與ADME分析

TCMSP 數(shù)據(jù)庫共檢索出白芍相關(guān)成分85 個(gè)，經(jīng)OB 和DL 篩選出13 個(gè)，查詢靶點(diǎn)及相關(guān)文獻(xiàn)后剔除4個(gè)，最終納入有效活性成分9個(gè)，見表1。

表1 白芍活性成分表

2.2 “活性成分－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)技術(shù)得到80 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，經(jīng)Cytoscap 3.7.2繪制白芍“活性成分－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共存在90 個(gè)節(jié)點(diǎn)（包含80 個(gè)靶點(diǎn)和9 個(gè)活性成分）和138 條關(guān)系，見圖1。節(jié)點(diǎn)面積越大表示度值越大，生物學(xué)功能和重要性相應(yīng)提升。

圖1 白芍“活性成分－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)獲取

檢索TTD、OMIM、GeneCards、DrugBank、CTD 數(shù)據(jù)庫，分別得到疾病靶點(diǎn)133、545、29、67、100 個(gè)，匯總?cè)ブ睾蠊灿?jì)793 個(gè)。繪制Venn 圖，見圖2，可視化展示二者交集，可見白芍治療SLE的潛在靶點(diǎn)有20個(gè)。

圖2 白芍治療SLE的潛在靶點(diǎn)Venn圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

利用BisoGenet插件分別構(gòu)建白芍和SLE的PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)白芍可通過2 989 個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮作用，其間相互關(guān)系達(dá)70 169 條；SLE 潛在靶點(diǎn)有7 476 個(gè)，關(guān)聯(lián)達(dá)176 712條，二者交集網(wǎng)絡(luò)見圖3。

圖3 白芍與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的PPI交集網(wǎng)絡(luò)

為進(jìn)一步擴(kuò)充節(jié)點(diǎn)連接信息、提升傳遞效率、明確關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了2次拓?fù)鋵傩院Y選，得到關(guān)鍵靶點(diǎn)278個(gè)，篩選策略和最終結(jié)果見圖4～5。

圖4 白芍干預(yù)SLE關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的篩選策略

2.5 白芍“活性成分－靶點(diǎn)－疾病”生物學(xué)功能和通路分析

運(yùn)用DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，并根據(jù)所涉及的信號(hào)通路推測(cè)潛在作用機(jī)制。取GO 富集BP 模塊中P值＜0.1、KEGG 中P值＜0.05 的結(jié)果繪制氣泡圖，結(jié)果見圖6。其中，橫軸為通路基因在總體中所占的比率，縱軸為富集名稱，氣泡顏色由紅到綠表示-log10（P）值依次減小，氣泡大小代表該通路所包含的基因數(shù)。

圖6 白芍治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡作用靶點(diǎn)富集分析氣泡圖

圖5 白芍核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

GO 富集得到127 個(gè)結(jié)果，其中BP 94 個(gè)，CC 6 個(gè)，MF 27 個(gè)，KEGG 富集得到34 條通路。分析結(jié)果提示：白芍調(diào)控SLE主要涉及炎癥反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、細(xì)胞因子合成、氧化應(yīng)激抵抗、激素藥物反應(yīng)和細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程，以及TNF、花生四烯酸代謝、Nod 樣受體（NOD－like receptor signaling pathway，NLR）、Toll 樣受體（toll－like receptor signaling pathway，TLR）、癌癥、細(xì)菌感染、激素合成等多條信號(hào)通路。

2.6 “成分－靶點(diǎn)－通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)KEGG 及其映射的顯著差異基因，構(gòu)建“成分－靶點(diǎn)－通路”網(wǎng)絡(luò)，包括22條信號(hào)通路、17個(gè)基因靶點(diǎn)、7個(gè)成分和119條關(guān)系，見圖7。據(jù)圖推測(cè)，白芍干預(yù)SLE 的關(guān)鍵靶基因可能為Degree 值較大的TNF、CASP3、IL6、CASP8、TGFB1、NOS2。

圖7 “成分－靶點(diǎn)－通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

SLE 可歸屬“痹病”“陰陽毒”“紅蝴蝶瘡”等范疇［30］。臨床醫(yī)家多認(rèn)為SLE 證屬本虛標(biāo)實(shí)，毒蘊(yùn)血瘀是病理關(guān)鍵，故以扶正祛邪為治療大法［31］。白芍是毛茛科植物芍藥的干燥根，性微寒，味苦而酸，入肝、脾經(jīng)，可養(yǎng)血柔肝止痛、斂陰平抑肝陽，是風(fēng)濕免疫病組方常用中藥。藥理學(xué)研究證實(shí)［32］，白芍具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抗氧化等功效。臨床從氣、血、水辨治SLE，取白芍滋陰利水、扶脾胃、解藥毒之效，療效確切［33］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)整體觀念高度重合，故筆者選用這一方法探索白芍治療SLE的起效機(jī)制。

本研究共篩選出芍藥苷、兒茶素、山柰酚在內(nèi)的白芍核心成分9 個(gè)，涉及60 個(gè)靶點(diǎn)，富集結(jié)果分布在NF－κB、TNF、Toll 樣受體、Nod 樣受體及花生四烯酸代謝、癌癥、雌激素等信號(hào)通路，充分展現(xiàn)出了白芍多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療SLE的特點(diǎn)。

研究顯示［34-35］，芍藥苷可通過NF－κB和ERK通路相關(guān)機(jī)制阻礙TNF－α 誘導(dǎo)趨化因子的產(chǎn)生和白細(xì)胞遷移，從而發(fā)揮體外抗炎作用；還可抑制免疫調(diào)節(jié)因子及組織蛋白mRNA表達(dá)、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫以治療疾?。?6］；同時(shí)能促進(jìn)骨髓造血以增強(qiáng)免疫功能［37］，與扶正固本的中醫(yī)思想不謀而合。目前廣泛應(yīng)用的白芍總苷復(fù)合制劑含40%以上芍藥苷成分，具有抗炎和雙向免疫調(diào)節(jié)等作用［38-39］，且療效溫和、適用性強(qiáng)、安全性佳，已成為臨床優(yōu)選用藥方案［40-41］。兒茶素憑借對(duì)Th17/Treg特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR－γt mRNA/Foxp3 mRNA 表達(dá)的雙重調(diào)節(jié)作用，使機(jī)體恢復(fù)免疫平衡狀態(tài)［42］。山柰酚可使免疫抑制細(xì)胞Treg 活化，實(shí)現(xiàn)免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)［43］。

根據(jù)富集結(jié)果推測(cè)白芍治療SLE 的起效機(jī)制，可概括為以下兩種：

（1）直接調(diào)控TLRs、NLRs、NF－κB、TNF 等信號(hào)通路。TLRs通路以NF－κB活化和免疫應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄為主，TLR 屬于模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR），可特異性識(shí)別病原體并啟動(dòng)炎癥信號(hào)通路［44］。研究發(fā)現(xiàn)［45-46］，B 細(xì)胞中固有的TLR7 缺失可抑制自身免疫；相反TLR9缺失則促使免疫復(fù)合物（IC）沉積，加劇系統(tǒng)性炎癥；TLR9激活是SLE常見并發(fā)癥狼瘡腎炎發(fā)生的重要原因［47］。多效應(yīng)細(xì)胞因子TNF－α由T 細(xì)胞和單核－巨噬細(xì)胞分泌，通過影響機(jī)體免疫應(yīng)答參與SLE 發(fā)病過程［48］；還能加劇組織相容性抗原之間的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致疾病進(jìn)展［49］。NLR 家族同屬天然免疫PRR，在病原和損傷相關(guān)分子模式的識(shí)別中舉足輕重［50］。家族中的NOD 蛋白和配體結(jié)合后，可通過下游受體蛋白的相互作用激活NF－κB 通路，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子及趨化因子轉(zhuǎn)錄上調(diào)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［51-52］，還能催化凋亡相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)以及參與1 型糖尿病等適應(yīng)性免疫反應(yīng)的啟動(dòng)［53］。白芍或許能直接調(diào)控上述通路，從而改善SLE。

（2）間接調(diào)控信號(hào)通路和多系統(tǒng)代謝靶點(diǎn)?；ㄉ南┧嵬ㄟ^COX 酶代謝生成前列腺素，引起疼痛、血管擴(kuò)張（腫脹和紅腫）和發(fā)熱等癥狀［54-55］；5－LO 酶與激活蛋白結(jié)合推動(dòng)花生四烯酸轉(zhuǎn)化形成白三烯，促使中性粒細(xì)胞趨化［56］。雌激素促炎和抗炎雙向作用分別由受體ER－α、β介導(dǎo)，其表達(dá)量分別同SLE患者病情活動(dòng)度呈正、負(fù)相關(guān)［57］。雌激素可選擇性激活或抑制miR－145、miR－125a和miR－146a等SLE相關(guān)miRNA，影響基因表達(dá)［58］。白芍可能通過干預(yù)上述通路，間接發(fā)揮對(duì)SLE的治療作用。

另外GO 富集分析網(wǎng)絡(luò)覆蓋細(xì)胞色素P450 酶代謝、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)營養(yǎng)、脂肪細(xì)胞因子和卵巢類固醇合成、癌癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、2 型糖尿病等信號(hào)通路，說明白芍可調(diào)控多個(gè)系統(tǒng)和多種代謝途徑靶點(diǎn)，從而影響自身免疫狀態(tài)、干預(yù)SLE病理過程。

4 結(jié)語

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，擬深挖白芍物質(zhì)基礎(chǔ)和對(duì)SLE 的起效機(jī)制，研究結(jié)果與已知文獻(xiàn)報(bào)道吻合，驗(yàn)證了靶點(diǎn)預(yù)測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性，也為中醫(yī)新藥研發(fā)、臨床應(yīng)用及后續(xù)研究提供了新的依據(jù)。但囿于這一手段的局限性和機(jī)體反應(yīng)的非單一性，僅就白芍的藥理成分進(jìn)行預(yù)測(cè)探討，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步挖掘和驗(yàn)證。