麥靜愔，陳澍，柯碧蓮，何青青，王浩藝，平鍵，陳建杰，成揚(yáng)

（1.上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200052；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040；3.上海市第一人民醫(yī)院，上海 200080；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

原發(fā)性肝癌是高病死率的惡性腫瘤之一，給世界各國(guó)人民的健康帶來極大危害。我國(guó)是原發(fā)性肝癌的重災(zāi)區(qū)，患者數(shù)量和病死率均占世界前列。目前肝癌治療尚無特效藥，基本采用綜合治療方案，早期以手術(shù)治療為主，對(duì)無法手術(shù)或者不能耐受手術(shù)的，采用TACE、姑息治療和綜合對(duì)癥處理，以此控制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)患者生存期［1－2］。肝癌是一種具有高轉(zhuǎn)移潛能的惡性腫瘤，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是大多數(shù)肝癌患者治療失敗和死亡的主要原因。上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散的初始步驟，可導(dǎo)致惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此抑制腫瘤細(xì)胞EMT 的發(fā)生對(duì)腫瘤的治療具有積極意義［3－4］。

在肝癌的預(yù)防治療中，從中醫(yī)藥寶庫(kù)中發(fā)掘有效的輔助治療方法，無疑是其發(fā)展方向之一［1］。蒼術(shù)為菊科草本植物茅蒼術(shù)［Atractylodes lancea（Thunb.）DC.］或北蒼術(shù)［Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.］的干燥塊莖，味辛、苦，性溫，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒的功效，是臨床許多中藥方劑的重要組成部分。蒼術(shù)酮是從蒼術(shù)中分離得到的倍半萜類有效成分，現(xiàn)代藥理研究表明，蒼術(shù)酮具有保肝、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理活性［5－6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)酮可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［7］。本研究擬在既往研究基礎(chǔ)上，通過在非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（non－obese diabetes/server combined immune deficiency，NOD/SCID）小鼠左側(cè)背部皮下種植HepG2 細(xì)胞懸液的方法制備肝癌荷瘤小鼠模型，以進(jìn)一步研究蒼術(shù)酮對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、EMT 和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 肝癌細(xì)胞株培養(yǎng)

肝癌細(xì)胞株HepG2（美國(guó)ATCC，MD，USA）采用常規(guī)傳代保種。細(xì)胞使用DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）培養(yǎng)，添加10%胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）和1%的青霉素和鏈霉素（美國(guó)Hyclone 公司），于5%CO2，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 模型制備、分組和給藥

NOD/SCID 小鼠，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡，購(gòu)自北京華阜康公司。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度（22 ± 2）°C，濕度50%～60%。所有動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)環(huán)境1 周后開始實(shí)驗(yàn)。在NOD/SCID 小鼠左側(cè)背部，皮下種植100 μL的HepG2細(xì)胞懸液，劑量為1×107/只。當(dāng)注射位置腫瘤生長(zhǎng)到50～100 mm3之后，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、蒼術(shù)酮低劑量組（低劑量組）和蒼術(shù)酮高劑量組（高劑量組），每組6只。根據(jù)課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，將蒼術(shù)酮溶于玉米油中，低、高劑量組分別按照5、10 mg/kg劑量灌胃給藥；對(duì)照組給予玉米油灌胃。每日1 次，共15 d。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1 腫瘤組織體積與質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，采集血液和相應(yīng)組織標(biāo)本，腫瘤瘤體立刻拍照并稱重，取部分腫瘤組織固定于福爾馬林溶液中，待進(jìn)一步檢測(cè)。皮下腫瘤體積測(cè)量公式如下：

腫瘤體積（mm3）=0.5×L×W2

其中，L是腫瘤長(zhǎng)度，W是寬度。

1.3.2 免疫組化染色法觀察腫瘤組織細(xì)胞增殖情況

將固定好的腫瘤組織采用石蠟進(jìn)行包埋，切成5 μm 組織切片，貼附在載玻片上。使用二甲苯和梯度分級(jí)乙醇對(duì)切片進(jìn)行脫蠟和再水化，再將切片浸入目標(biāo)回收溶液中水浴30 min。用3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶15 min，用山羊血清阻斷非特異性結(jié)合50 min。切片依次用Ki－67 Ⅰ抗和HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗聚合物共孵育反應(yīng)，最后用DAB 染色和甲基綠復(fù)染，在顯微鏡下觀察拍攝。

1.3.3 Western blot 法檢測(cè)腫瘤組織EMT 標(biāo)志物、凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平

用含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）裂解組織樣品，使用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用5%脫脂牛奶阻斷非特異性結(jié)合1.5 h，Ⅰ抗（Bcl－2、Bax、裂解Caspase－3、α－SMA、波形蛋白、N－鈣黏蛋白、E－鈣黏蛋白、MMP－2、MMP－9、TIMP－2和GAPDH）在膜上孵育4°C 過夜。Ⅱ抗在室溫下孵育1 h。通過化學(xué)發(fā)光試劑顯示蛋白質(zhì)條帶，采用Amersham prime ECL Plus detection system（Pittsburgh，PA）進(jìn)行定量檢測(cè)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0 軟件，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蒼術(shù)酮對(duì)肝癌荷瘤小鼠腫瘤體積和質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組肝癌荷瘤小鼠的腫瘤體積和質(zhì)量都比較大。經(jīng)治療后，低、高劑量組的腫瘤組織體積和質(zhì)量均明顯下降（P＜0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴性，且高劑量組明顯低于低劑量組（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤體積和質(zhì)量比較（±s）

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤體積和質(zhì)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P ＜0.01；與低劑量組比較，2）P ＜0.05。

組別對(duì)照組低劑量組高劑量組n6 6 6腫瘤體積（mm3）810.90±111.54 392.85±69.131）329.82±58.231）2）腫瘤質(zhì)量（mg）730.81±53.70 238.96±40.571）190.41±41.281）2）

圖1 肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織

2.2 蒼術(shù)酮對(duì)肝癌荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞增殖的影響

Ki－67 免疫組化染色顯示，對(duì)照組Ki－67 陽(yáng)性染色面積十分明顯，顯示皮下注射的HepG2 細(xì)胞增殖活躍；蒼術(shù)酮組Ki－67 陽(yáng)性染色面積均顯著縮小，尤其以高劑量組最為明顯?？梢?，蒼術(shù)酮治療抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。見圖2。

圖2 肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織Ki-67免疫組織化學(xué)染色圖（×100）

2.3 蒼術(shù)酮對(duì)肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織EMT 標(biāo)志物的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，低、高劑量蒼術(shù)酮的干預(yù)均對(duì)EMT（E－鈣黏蛋白、N－鈣黏蛋白、波形蛋白和α－SMA）和EMT促進(jìn)因子（MMP－2、MMP－9和TIMP－2）的表達(dá)產(chǎn)生了作用。與對(duì)照組相比較，低、高劑量組均顯著上調(diào)了上皮標(biāo)記物（E－鈣黏蛋白）的表達(dá)，下調(diào)了間充質(zhì)標(biāo)記物（N－鈣黏蛋白、波形蛋白和α-SMA）的表達(dá)，顯著增加了TIMP-2的表達(dá)，降低了MMP-2和MMP-9的表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3、表2。

表2 各組荷瘤小鼠腫瘤組織EMT標(biāo)記物的蛋白表達(dá)量比較（±s）

表2 各組荷瘤小鼠腫瘤組織EMT標(biāo)記物的蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P ＜0.01，2）P ＜0.05；與低劑量組比較，3）P ＜0.01，4）P ＜0.05。

組別對(duì)照組低劑量組高劑量組n6 6 6 TIMP－2 0.104±0.001 0.207±0.0231）0.483±0.0521）3）MMP－2 0.878±0.067 0.353±0.0281）0.306±0.0241）MMP－9 0.826±0.070 0.255±0.0241）0.242±0.0221）N－鈣黏蛋白0.499±0.044 0.328±0.0232）0.134±0.0291）3）E－鈣黏蛋白0.085±0.012 0.193±0.0291）0.277±0.0591）3）波形蛋白1.556±0.129 0.533±0.0551）0.104±0.0201）3）α－SMA 0.886±0.071 0.334±0.0341）0.251±0.0341）4）

圖3 各組肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織EMT標(biāo)記物檢測(cè)結(jié)果

2.4 蒼術(shù)酮對(duì)肝癌荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的影響

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低、高劑量蒼術(shù)酮的干預(yù)均顯著降低了Bcl-2 的表達(dá)水平，顯著增加了Bax 和裂解Capase-3 的表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與低劑量組比較，高劑量組影響更顯著。見圖4、表3。

圖4 肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl-2、Bax和裂解Caspase-3檢測(cè)結(jié)果

表3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl－2、Bax和裂解Caspase－3的蛋白表達(dá)量比較（±s）

表3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl－2、Bax和裂解Caspase－3的蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P ＜0.01，2）P ＜0.05；與低劑量組比較，3）P ＜0.05，4）P ＜0.01。

組別對(duì)照組低劑量組高劑量組n6 6 6 Bcl－2 0.663±0.058 0.203±0.0251）0.123±0.0201）3）Bax 0.561±0.037 0.731±0.0772）1.094±0.0431）4）裂解Capase－3 0.265±0.033 0.398±0.0372）0.882±0.0761）4）

3 討論

由于肝癌早期臨床癥狀常不明顯，大多數(shù)患者在確診時(shí)已發(fā)展到晚期，導(dǎo)致治療十分困難，預(yù)后較差。腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能夠促進(jìn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這是肝癌患者高復(fù)發(fā)率和高病死率的主要原因之一。由于肝癌發(fā)病的分子機(jī)制十分復(fù)雜，目前臨床藥物的療效有限，效果不甚理想［8］。近年來中醫(yī)藥在對(duì)肝癌的治療中不斷取得進(jìn)展，可從整體上系統(tǒng)地調(diào)控機(jī)體抑制腫瘤，在臨床上已經(jīng)漸漸顯露出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［1－2］。中草藥提取物或其衍生物已成為發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新型抗癌藥物的重要來源［5－6］。作為從蒼術(shù)中分離得到的活性成分，既往研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)酮能夠降低肝癌HepG2 細(xì)胞線粒體膜電位，增加細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，誘導(dǎo)其早期凋亡，并可呈劑量依賴性地抑制肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖和遷移［7］。本次研究發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)酮在整體動(dòng)物模型上能夠抑制NOD/SCID 小鼠皮下荷瘤的生長(zhǎng)，減少了腫瘤體積和質(zhì)量；Ki－67 免疫組化染色顯示其抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，表明其具有一定的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。

大量證據(jù)表明，上皮細(xì)胞惡性腫瘤可以通過EMT獲得遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移［9］。EMT 的主要特征是上皮標(biāo)記物，如E－鈣黏蛋白和ZO－1 的丟失，并伴隨間充質(zhì)標(biāo)記物，如波形蛋白、α－SMA 和N－鈣黏蛋白的增加［10］。本次研究結(jié)果顯示，蒼術(shù)酮干預(yù)上調(diào)了上皮標(biāo)志物E－鈣黏蛋白水平，降低了間充質(zhì)標(biāo)志物α－SMA、N－鈣黏蛋白和波形蛋白水平。結(jié)果提示表面蒼術(shù)酮能夠抑制肝癌皮下荷瘤的EMT 過程。

由于腫瘤轉(zhuǎn)移是涉及一系列復(fù)雜相互作用的多步驟過程，細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵步驟。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族是一類重要的降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中起重要作用，MMP 的高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。MMP－2 和MMP－9 是兩種重要的MMP，在多種腫瘤中高表達(dá)，在降解細(xì)胞外基質(zhì)基本骨架Ⅳ膠原中發(fā)揮重要作用［11－12］。本研究發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)酮能有效抑制MMP－2 和MMP－9 的表達(dá)，并增加MMP 抑制劑TIMP－2 的表達(dá)。綜合這些結(jié)果表明，蒼術(shù)酮可通過抑制EMT和下調(diào)MMP－2和MMP－9的表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

Bcl－2家族蛋白在線粒體依賴性凋亡中起主要調(diào)節(jié)作用，在正常情況下，Bax 定位于細(xì)胞質(zhì)并與Bcl－2結(jié)合形成異二聚體，穩(wěn)定促凋亡蛋白的胞質(zhì)定位，抑制細(xì)胞凋亡。如果Bcl－2/Bax 平衡被凋亡誘導(dǎo)信號(hào)破壞，導(dǎo)致Bax 與Bcl－2/Bax 異二聚體分離并轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，即可啟動(dòng)凋亡途徑［13－15］。本次研究結(jié)果顯示，蒼術(shù)酮顯著降低了Bcl－2 的表達(dá)水平，增加了Bax和裂解Caspase－3的表達(dá)水平，結(jié)合既往研究，顯示其可能通過凋亡途徑發(fā)揮對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用［7］。

綜合研究結(jié)果顯示，蒼術(shù)酮具有一定的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)，可通過抑制EMT 和下調(diào)MMP－2 和MMP－9的表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，通過凋亡抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。綜合國(guó)內(nèi)外研究顯示，蒼術(shù)酮具有抗腫瘤、降血壓、保護(hù)呼吸系統(tǒng)、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、保肝、抗流感病毒和除螨等廣泛良好的藥理活性［5，16－17］。深入開展對(duì)蒼術(shù)酮治療肝癌的研究，可擴(kuò)展對(duì)該成分在現(xiàn)代藥理學(xué)方面的新認(rèn)識(shí)，也對(duì)合理開發(fā)中藥新藥具有重要意義。