屈直，王芬，李志明，張燕娜，王玥慧

（北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計報告，肺癌是世界病死率最高及發(fā)病率第二的癌癥［1］，也是21世紀以來迅速發(fā)展的疾病之一。我國是全球范圍內肺癌疾病負擔最重的國家［2］，在老齡化、環(huán)境污染、吸煙等多重因素的影響之下，新罹患肺癌和以肺癌為主要死亡原因的患者人數(shù)逐年遞增。目前臨床上多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時即是中晚期，其五年生存率尚不到20%［3］。鉑類藥物化療是治療肺癌的主要手段，然而其耐藥性、副作用、效益率低等問題成為制約其臨床療效的瓶頸［4］?，F(xiàn)代研究表明，中醫(yī)藥在調節(jié)免疫功能、促進凋亡、抑制血管生成等方面對肺癌的治療有較好的作用［5］。二陳湯是臨床經(jīng)典方藥，具有燥濕化痰、理氣和中的功效。前期研究顯示，二陳湯加減方聯(lián)合含鉑化療方案可降低痰證非小細胞肺癌患者外周血中IL－17 的表達［6］。在動物實驗中，二陳湯加減方的抑瘤率為34.71%，且可改善小鼠體內CD4+T 淋巴細胞水平［7］。本次研究通過以二陳湯干預Lewis 肺癌小鼠，觀察其對移植瘤的作用，并進一步研究其對VEGF/VEGFR－2 分子軸以及對PI3K/Akt通路的影響，探討其抗肺癌的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及瘤株

40 只4～6 周齡C57BL/6 雄性小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2014－0004。在中國醫(yī)學科學院基礎研究所SPF 級動物房進行飼養(yǎng)以及給藥，環(huán)境溫度23～26 ℃，相對溫度50%～60%，環(huán)境噪音＜60 dB。用于造模的Lewis 瘤株由中國醫(yī)學科學院基礎研究所提供。

1.2 實驗藥物

二陳湯（組方：法半夏15 g，陳皮15 g，茯苓9 g，炙甘草6 g，生姜7 g和烏梅8 g）中所包含中藥均由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院中藥房提供，常規(guī)水煎煮，根據(jù)小鼠與人的劑量換算公式［6］計算出小鼠每日劑量，將藥液濃縮至1.35 g/mL，冷凍保存。10 mg/瓶注射用順鉑，由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院西藥房提供，批號：AA1A7030B。

1.3 實驗試劑

VEGFR－2、VEGF 抗體（Abcam 公司，貨號：ab68153、ab39256）；PI3K、Akt 抗體（CST 公司，貨號：6342S、4968S）；β－肌動蛋白抗體（Proteintech group，貨號：Ag27042）；CD34 抗體（Proteintech group，貨號：14486－1－AP）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：PC0020）。

1.4 實驗儀器

超凈工作臺（VD－650）；倒置顯微鏡（日本，Olympus公司）；5810 R離心機（德國，Eppendorf 公司）；酶標儀（美國，Pro－mega 公司）；DYCZ－24DH 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；92－14860－00 型凝膠成像系統(tǒng)（美國，Alpha Innotech公司）。

1.5 Lewis肺癌小鼠造模及分組給藥

40只小鼠隨機分為對照組、中藥組、聯(lián)合組和順鉑組，每組各10 只。將細胞密度為6×106個/mL 的小鼠Lewis 肺癌細胞在C57BL/6 小鼠右腋下以0.2 mL/只的劑量進行皮下注射接種。7 d后，可在小鼠腋窩皮下觀察到綠圓形隆起，則標志著造模成功。造模成功后，對照組予以0.4 mL 生理鹽水日1 次灌胃；中藥組予以0.4 mL 二陳湯藥液日1 次灌胃；順鉑組予以0.4 mL 生理鹽水灌胃的同時，用注射用順鉑以200 μL/20 g 劑量進行腹腔內灌注，每隔3 d灌注1次；聯(lián)合組同時給予中藥灌胃和順鉑腹腔內灌注。各組小鼠均連續(xù)干預15 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般生存狀態(tài)觀察

每日觀察各組小鼠的外在一般行為狀態(tài)、進食量、排便、氣味和毛色的狀況，每周稱量1 次體質量，并對各組小鼠的狀態(tài)進行評估。

1.6.2 Lewis肺癌小鼠抑瘤率測定

第21 天給藥結束24 h 后，用脫椎法處死小鼠，剝離腫瘤組織稱重并計算抑瘤率，腫瘤組織分成兩部分，一部分置于甲醛中固定，另一部分于－20 ℃冷凍保存。

抑瘤率=（模型組平均瘤質量－治療組平均瘤質量）/模型組平均瘤質量× 100%

1.6.3 免疫組化法檢測各組Lewis 小鼠瘤組織中VEGF、VEGFR－2、PI3K、Akt的含量及MVD值

用病理切片機將石蠟包埋后的腫瘤組織制成切片，脫蠟水化后用3%過氧化氫洗滌，將切片置于抗原修復液中進行修復（置于微波爐中，高火加熱15 min），取出待其冷卻，滴加一抗（稀釋濃度為1∶100），放入濕盒中過夜，第2天將組織37 ℃恒溫孵育30 min，沖洗后加入二抗，等待30 min 后進行顯色，蘇木精復染，脫水封片，封好后在顯微鏡下觀察蛋白的表達及分布，通常蛋白表達可見細胞核中及胞質中有棕黃色顆粒樣物質，用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖像，蛋白的表達水平以IOD值表示。

CD34 染色后，選擇2 個血管化程度較高的區(qū)域進行微血管計數(shù)，采用低光度數(shù)（× 10 物鏡）進行計數(shù)。最終的MVD 值為每個高血管化區(qū)域（總面積：2.65 mm2）3個高倍視野（×25物鏡）的平均值。具有清晰管腔或明確線形血管形狀的血管用于計數(shù)。

1.6.4 Western blot 法檢測各組Lewis 小鼠瘤組織中PI3K、Akt、VEGF、VEGFR－2蛋白含量

將腫瘤組織剪碎在冰上進行慢速研磨，研磨后所獲得的溶液進行細胞裂解并抽提蛋白，用BCA 檢測試劑盒測定所獲得的蛋白濃度。蛋白變性后，冷卻上樣，凝膠電泳半干法轉入PVDF 膜后置于封閉緩沖液（搖床振蕩1 h），分別加入目的蛋白一抗，4 ℃過夜，TBST洗滌后孵育二抗，用ECL 顯影條帶顯影并輸入電腦進行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

本實驗采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)資料進行處理，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，統(tǒng)計學方法采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；不滿足正態(tài)分布則使用非參數(shù)檢驗進行分析；計數(shù)資料采用卡方檢驗。以P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般生存狀態(tài)比較

通過觀察，各組小鼠在接種肺癌細胞1 周后均逐漸出現(xiàn)不同程度的皮毛光澤消失、脫落，反應遲緩，飲食量減少等現(xiàn)象，其中對照組小鼠尤為明顯。對照組及中藥組在造模后7 d 出現(xiàn)死亡狀況（對照組2 只，中藥組3 只，順鉑組1 只）。而聯(lián)合組小鼠一般狀況與其他組比較則相對較好，飲食量可，反應較靈敏，體質量無明顯下降，生存質量相對較好。

2.2 各組小鼠瘤重及抑瘤率比較

中藥組、聯(lián)合組及順鉑組抑瘤率分別為13.04%、22.94%和21.26%。經(jīng)檢驗，與對照組相比，中藥組、聯(lián)合組及順鉑組Lewis小鼠瘤重均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；順鉑組與中藥組瘤重比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余各組比較無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組小鼠瘤重及抑瘤率比較（±s）

表1 各組小鼠瘤重及抑瘤率比較（±s）

注：與中藥組比較，*P ＜0.05；與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組別對照組中藥組聯(lián)合組順鉑組n8 7 9 10瘤重（g）2.75±0.24 2.45±0.44#2.02±0.57##2.20±0.42*##抑瘤率（%）—13.04 22.94 21.26

2.3 各組小鼠腫瘤組織中CD34 表達值及微血管密度（MVD）比較

聯(lián)合組瘤體組織中CD34的表達值及MVD 相較于其他組均明顯降低，且在一定的濃度范圍內隨濃度增高而降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。順鉑組CD34 的表達值及MVD 也有所下降，與其他組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腫瘤組織中CD34表達值及MVD比較（±s）

表2 各組小鼠腫瘤組織中CD34表達值及MVD比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與中藥組比較，#P ＜0.05。

組別對照組中藥組聯(lián)合組順鉑組n8 7 9 10 CD34 41.07±7.22 35.15±10.74 18.15±5.45*#36.12±7.65 MVD（mm2）47.80±6.73 43.64±18.06 28.68±6.05*#32.22±8.33

2.4 各組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR－2 表達情況比較

與對照組、中藥組相比，聯(lián)合組、順鉑組腫瘤組織中VEGFR－2 蛋白表達明顯減少（P＜0.05）。而各組之間VEGF 蛋白的表達量經(jīng)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示二陳湯作用于VEGF/VEGFR－2 分子軸的機制主要是通過抑制VEGFR 的表達。與順鉑組比較，聯(lián)合組雖然VEGFR－2 的蛋白表達量更低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見圖1、圖2、表3。

表3 各組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR－2表達比較（±s）

表3 各組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR－2表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與中藥組比較，#P ＜0.05。

組別對照組中藥組聯(lián)合組順鉑組n8 7 9 10 VEGFR－2 0.41±0.15 0.36±0.14 0.12±0.09*#0.25±0.07*#VEGF 0.58±0.12 0.42±0.12 0.45±0.17 0.33±0.15

圖1 各組小鼠瘤組織中VEGF、VEGFR－2蛋白表達情況

圖2 免疫組化檢測各組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR－2表達情況（×400）

2.5 各組小鼠腫瘤組織中PI3K、Akt 蛋白表達情況比較

與對照組、中藥組相對比，聯(lián)合組、順鉑組小鼠腫瘤組織中PI3K、Akt 蛋白的表達量減少（P＜0.05）；聯(lián)合組與順鉑組比較，雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而中藥組與對照組經(jīng)比較，蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4、圖3、圖4。

圖3 免疫組化檢測各組小鼠腫瘤組織中PI3K和Akt的表達情況（×400）

圖4 各組小鼠腫瘤組織PI3K、Akt蛋白表達情況

表4 各組小鼠腫瘤組織中PI3K、Akt蛋白表達量比較（±s）

表4 各組小鼠腫瘤組織中PI3K、Akt蛋白表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與中藥組比較，#P ＜0.05。

組別對照組中藥組聯(lián)合組順鉑組n8 7 9 10 PI3K 0.54±0.12 0.43±0.16 0.17±0.12*#0.12±0.09*#Akt 0.77±0.14 0.58±0.17 0.24±0.11*#0.18±0.07*#

3 討論

二陳湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，目前在各類呼吸系統(tǒng)疾病的治療中廣泛應用［8］。痰證為肺癌常見中醫(yī)證候［9］，二陳湯在臨床上應用于辨證為肺脾氣虛兼見痰濕，癥見乏力納呆、便溏少氣懶言、痰多色白、惡心嘔吐等的肺癌患者?！夺t(yī)宗必讀》云：“脾為生痰之源，肺為儲痰之器”，脾胃主運化水濕，肺主通調水道，若脾胃運化無力，肺氣不利，則津液營養(yǎng)物質集聚于肺而成痰，故治療痰飲宜在溫化、淡滲、燥濕的同時調理肺脾。方中君藥半夏辛溫，能燥濕化痰、和胃降逆止嘔；陳皮理氣燥濕化痰；茯苓健脾淡滲利濕；生姜降逆化痰止嘔；烏梅收斂肺氣；甘草健脾和中、調和諸藥。其組方配伍標本兼顧，為燥濕化痰、理氣和胃的基礎方劑。二陳湯在歷代醫(yī)家臨床治療中更是根據(jù)患者的辨證情況化裁演變出了導痰湯、溫中化痰丸等臨床常用成方。

研究顯示VEGF/VEGFR 軸是腫瘤調節(jié)血管生成的關鍵分子軸［10］。而腫瘤細胞在過度增殖過程中，微環(huán)境氧缺乏是誘導腫瘤血管生成的主要因素，環(huán)境中高水平的缺氧誘導因子1α（HIF－1α）則促進了肺癌細胞表達因子VEGF 增多［11］。VEGF 家族包括VEGFA、VEGF－B、VEGF－C、VEGF－D 等。VEGF 因子通過與其位于血管內皮細胞膜上的受體VEGFR 結合后，便會釋放各種生長因子及細胞因子，促進腫瘤組織中的血管生成。VEGFR 分子根據(jù)其結構通常又有三種：VEGFR－1/Flt－1、VEGFR－2/Flk－1/KDR 和VEGFR－3/Flt－4，在腫瘤組織內發(fā)揮促血管內皮細胞增殖作用的主要是VEGFR－2［12］。研究表明，磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）信號通路在多種癌細胞中被廣泛激活。該信號通路起始于PI3K 的活化，導致磷脂酰肌醇－3，4，5的產(chǎn)生，從而激活蛋白激酶B 和下游的mTOR 通路［13］。VEGFR－2 可通過HIF－1α 激活PI3K/Akt/mTOR 通路，從而發(fā)揮調控血管新生與重塑的作用。相應的PI3K/Akt/mTOR 通路激活后又可以通過HIF－1α 依賴性或非依賴性機制反過來提高VEGF 的分泌，從而形成一個正反饋環(huán)［14］。故通過阻斷PI3K/Akt 通路，可以起到影響腫瘤血管生成的作用。

本研究結果顯示，與化療藥物順鉑聯(lián)用，二陳湯具有一定的抑瘤作用，且聯(lián)合組在提高小鼠的生活質量及免疫功能方面作用較單用順鉑組更加突出。二陳湯聯(lián)合順鉑可減少Lewis 小鼠腫瘤組織中VEGF 及其受體VEGFR－2 的表達，從而對腫瘤血管生成起到抑制作用。不僅如此，在抑制VEGF/VEGFR－2分子軸的同時，二陳湯聯(lián)合順鉑還可以降低小鼠瘤體組織內PI3K、Akt 蛋白含量，從而達到多靶點、多方位調控腫瘤增殖和血管生成的作用。PI3K下游的mTOR酪氨酸激酶激活Akt，使其活化為p－Akt，形成二聚體，從細胞質轉移入細胞核中，活化后的PI3K 能在細胞核中長期穩(wěn)定存在，從而使其下游靶基因表達紊亂，最終導致細胞的異常增殖［15］。多個研究證實，在不同的癌種中，PI3K/Akt通路的活化與腫瘤的血管生成密切相關［16-18］，對于PI3K/Akt 通路及其與VEGF/VEGFR－2 分子軸交互作用在腫瘤中的機制研究仍有待進一步深入。

綜上，二陳湯能提高Lewis 肺癌小鼠整體的生存質量，聯(lián)合順鉑治療，可對小鼠移植瘤的增殖、血管生成有一定抑制作用，其機制為通過下調PI3K/Akt 通路繼而影響腫瘤組織中VEGF、VEGFR－2 分子的表達，從而起到抑制腫瘤血管生成的作用。二陳湯的作用是多靶點、整體性的調節(jié)，抗腫瘤血管生成是其抗腫瘤作用的重要機制之一。