張兵 朱亞輝 王孝玉 周思私 袁法

(南充市中心醫(yī)院骨科， 四川 南充 637000)

骨折指骨骼因直接或間接原因造成完整性破壞或連續(xù)性中斷，是一種常見臨床醫(yī)學疾病，可以通過治療恢復到原有的骨形態(tài)，如果不及時治療，會使骨折難以愈合，最終導致骨形態(tài)的畸形[1]。骨折愈合是一個非常復雜的動態(tài)生物過程，該過程涉及多種骨細胞、細胞因子和基因的相互作用，最終使骨組織恢復原有的結構和骨功能[2]。雖然骨骼愈合能力較強，但由于病因復雜，骨折類型多樣，有5%～10%的骨折患者在愈合過程中存在一定程度的障礙，導致骨折延遲愈合或骨不愈合，給患者造成身體不適。因此，明確骨折愈合的生理過程及其調控機制將有助于臨床上治療骨折[3-4]。

酸棗仁是植物酸棗的天然種子，在中國、日本、韓國等東方國家已有上千年的用藥歷史。酸棗仁皂苷A已被證明是酸棗仁的主要活性成分，既往研究表明酸棗仁皂苷A具有抗氧化、抗焦慮、抗炎和減少細胞凋亡等作用[5-6]，但目前關于酸棗仁皂苷A對骨細胞細胞增殖和分化的研究與報道鮮少。因此本實驗采用小鼠成骨細胞(MC3T3-E1)模擬骨組織生成與分化，探討酸棗仁皂苷A是否能通過促進成骨細胞增殖和分化，從而加快骨組織愈合速度，為臨床上治療骨折提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 小鼠成骨細胞(MC3T3-E1)，購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2 試劑 酸棗仁皂苷A，純度≥98%，購自成都曼思特生物科技有限公司；胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒均購自美國Gibco公司；CCK-8檢測試劑盒，堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)Elisa檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒、RNA逆轉錄試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；生長轉化因子-β1(TGF-β1)、膠原蛋白I (Col I)、骨成型蛋白-2(BMP-2)和β-肌動蛋白(β-actin)抗體均購自艾博抗(上海)貿易有限公司；所有引物及序列由上海生工股份有限公司提供。

1.3 儀器 MultiskanTMFC酶標儀、VeritiPro PCR儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、GX53倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、多功能凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)、蛋白質電泳儀(美國Bio-Rad公司)、CytoFLEX S流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)。

1.4 主要實驗方法

1.4.1 MC3T3-E1細胞的培養(yǎng) 將復蘇后的MC3T3-E1細胞置于含α-MEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)的培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，中途更換培養(yǎng)基1～2次，待細胞生長至80%鋪滿培養(yǎng)瓶底后，使用胰酶消化進行傳代備用。

1.4.2 CCK-8檢測細胞增殖率 收集處于生長對數(shù)期的MC3T3-E1細胞進行分組：空白組、酸棗仁皂苷A組(5、10、20、40 mg/L)，調整細胞密度為每100 μL約含1×104個細胞，接種至96孔板中過夜培養(yǎng)至貼壁，每組重復3次。待細胞貼壁后加入藥物并調整至對應的終濃度，空白組加入等量的完全培養(yǎng)基，添加藥物后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后加入10 μL CCK-8試劑，在室溫下孵育1 h，使用酶標儀在450 nm波長下檢測吸光度值并計算細胞增殖率。

1.4.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集處于生長對數(shù)期的MC3T3-E1細胞進行分組：空白組(完全培養(yǎng)基)、無血清對照組(不含血清的培養(yǎng)基)、酸棗仁皂苷A組(5、10、20、40 mg/L+不含血清的培養(yǎng)基)，調整細胞密度為1×103個/mL接種于6孔板中，每組重復3次。待細胞貼壁后加入藥物并調整至對應的終濃度，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按Annexin V-FITC試劑盒說明書提取操作，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.4.4 Von kossa染色法檢測細胞礦化結節(jié)生成程度 收集處于生長對數(shù)期的MC3T3-E1細胞分組：空白組、酸棗仁皂苷A組(5、10、20、40 mg/L)。先將蓋玻片預先置于6孔板中，然后將細胞密度調整為1×104個/mL接種于6孔板上，細胞貼壁后，空白組不加藥物，酸棗仁皂苷A組加入對應藥物繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基，持續(xù)誘導21 d。21 d后取出預置蓋玻片進行Von kossa法染色并在顯微鏡下拍照觀察。

1.4.5 Elisa法檢測細胞中ALP與BGP的水平 MC3T3-E1細胞成骨誘導21 d后用PBS清洗干凈，按Elisa試劑盒說明書進行操作，然后使用酶標儀進行檢測，計算各組細胞中ALP與BGP的水平。

1.4.6 實時熒光定量集合酶鏈式反應(RT-qPCR) MC3T3-E1細胞成骨誘導21 d后用PBS清洗干凈，按RNA提取試劑盒與RNA逆轉錄試劑盒說明書進行RNA提取與逆轉錄，然后使用RT-PCR儀計算各組樣本的CT值，采用2-△△CT法表示成骨特異性轉錄因子2(Runx-2)與骨鈣素(BGP)的相對表達水平。

1.4.7 蛋白質免疫印跡(Western Blot) MC3T3-E1細胞成骨誘導21 d后用冰PBS清洗干凈，按蛋白質提取試劑盒說明書操作進行蛋白質提取與定量，然后依次進行凝膠電泳、轉膜、封閉，一抗(TGF-β1(1：500)、Col I (1：500)、BMP-2(1：500)與β-actin (1：1200))過夜孵育，二抗(1：5000)中孵育2 h，然后使用ECL試劑盒進行顯影，將膜置于凝膠成像系統(tǒng)中進行發(fā)光分析，以β-actin作為內參，灰度值反映表達水平。

2 結果

2.1 酸棗仁皂苷A對MC3T3-E1成骨細胞的影響 與空白組相比，10～40 mg/L的酸棗仁皂苷A組對MC3T3-E1細胞有促進增值的作用，增殖效果隨濃度的升高而增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1)。與無血清對照組相比，5～40 mg/L酸棗仁皂苷A組能顯著降低MC3T3-E1細胞的凋亡率(P<0.05)，抑制凋亡的效果隨濃度的升高而增強，見表2、圖1。

表1 不同濃度的酸棗仁皂苷A對MC3T3-E1細胞增殖率的影響

表2 不同濃度的酸棗仁皂苷A對MC3T3-E1細胞凋亡率的影響

2.2 酸棗仁皂苷A對MC3T3-E1成骨細胞礦化結節(jié)生成的影響 與空白組相比，5～40 mg/L酸棗仁皂苷A組能顯著促進MC3T3-E1細胞中礦化結節(jié)的生成(均P<0.05)，結節(jié)生成數(shù)量隨濃度的升高而增多，見表3、圖2。

表3 酸棗仁皂苷A組對MC3T3-E1細胞礦化結節(jié)生成的影響

2.3 酸棗仁皂苷A組對MC3T3-E1成骨細胞分化的影響 與空白組相比，20～40 mg/L酸棗仁皂苷A組能顯著提高MC3T3-E1細胞中ALP的水平(P<0.05)，10～40 mg/L酸棗仁皂苷A組能顯著提高MC3T3-E1細胞中BGP的水平(P<0.05)，分化因子含量水平隨濃度的升高而升高，見表4。

表4 酸棗仁皂苷A對MC3T3-E1細胞中ALP與BGP水平的影響

2.4 酸棗仁皂苷A對MC3T3-E1成骨細胞分化基因的影響 與空白組相比，10～40 mg/L酸棗仁皂苷A組能顯著提高MC3T3-E1細胞中Runx-2基因的表達水平(P<0.05)，20～40 mg/L酸棗仁皂苷A組能顯著提高MC3T3-E1細胞中BGP基因的表達水平(P<0.05)，基因表達水平隨濃度的升高而升高，見表5。

表5 酸棗仁皂苷A對MC3T3-E1成骨細胞分化基因Runx-2與BGP表達的影響

2.5 酸棗仁皂苷A組對MC3T3-E1成骨細胞增殖與分化蛋白的影響 與空白組相比，5～40 mg/L酸棗仁皂苷A組能顯著提高MC3T3-E1細胞中TGF-β1、Col I與BMP-2的蛋白表達水平(P<0.05)，3種蛋白表達水平隨均濃度的升高而升高，見表6、圖3。

表6 酸棗仁皂苷A對MC3T3-E1成骨細胞分化蛋白TGF-β1、Col I與BMP-2表達水平的影響

3 討論

正常情況下，骨折愈合分為3個階段：血腫期(炎癥階段)、骨痂期(修復剪斷)以及重建期(骨重塑階段)[7]。同時，骨愈合也是復雜的細胞和生化過程的結果，其中骨膜、周圍軟組織和髓質在骨組織之外發(fā)揮著積極作用[8]。因此成骨細胞的增殖、分化與成熟是骨折愈合的關鍵。酸棗仁皂苷A具有許多生物效應[9]，對許多細胞均有保護作用，有研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁皂苷A能促進血管平滑肌細胞增殖，調節(jié)氧化應激平衡保護細胞[10]。在本研究中，CCK-8實驗結果說明酸棗仁皂苷A有保護成骨細胞的能力，為加快骨折愈合創(chuàng)造條件。

骨形成是由成骨細胞介導的，這些成骨細胞來自于骨髓間充質干細胞，被主轉錄因子Runx-2激活[11-12]。Runx-2可以促進成骨細胞分化，是決定成骨細胞分化方向的關鍵調控因子[13-14]。本研究對MC3T3-E1細胞進行酸棗仁皂苷A干預后，Runx-2基因表達增多，說明酸棗仁皂苷A可以通過上調Runx-2表達從而誘導骨細胞分化。成骨細胞分化的終末狀態(tài)是骨細胞，當成骨細胞達到終末分化時，會分泌不同的基質蛋白來補充骨基質，如膠原蛋白-1(Col-1)、BGP、ALP等[15-16]。ALP產生磷酸鈣沉積在成熟成骨細胞中，促進骨礦化，與BGP一起被用作骨形成的生物標志物，BGP水平的下降會導致骨代謝紊亂和骨結構異常[2，17]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁皂苷A作用MC3T3-E1細胞后，BGP基因的表達水平升高，同時細胞中ALP與BGP的含量升高，細胞中礦化結節(jié)數(shù)量增多，說明MC3T3-E1被酸棗仁皂苷A干預后正在高度分化，釋放出ALP與BGP，由此證明酸棗仁皂苷A有促進成骨細胞分化的能力。

骨形成蛋白(BMPs)在機體發(fā)育中發(fā)揮多種作用，參與骨發(fā)育和骨組織形成過程，具有較強的誘導分化和成骨能力[18-19]。BMPs主要通過典型的BMP信號通路發(fā)揮其生物學功能[20]。從成骨細胞形成骨痂，骨痂繼續(xù)鈣化使骨折達到臨床愈合，這一過程通常會持續(xù)3～6個月，而骨痂被吸收完全形成骨板階段會持續(xù)1～2年，這說明骨愈合是一個長期的生理過程。既往研究發(fā)現(xiàn)，轉化生長因子(TGF)可通過轉化發(fā)揮多種生物學作用，包括抑制組織凋亡、加速細胞分化、增加膠原含量、減少骨丟失[21-22]，也可以促進骨細胞的增殖，加速骨痂的形成，同時還能激活骨組織中纖維細胞的合成，增加膠原纖維含量，最終促進骨愈合[23]。前期研究發(fā)現(xiàn)，TGF/BMP信號通路參與骨形成，TGF-β1可以增強BMP-2誘導的成骨功能[24]。本實驗結果顯示，酸棗仁皂苷A作用MC3T3-E1細胞后，Col I、BMP-2與TGF-β1的蛋白表達水平明顯升高，說明酸棗仁皂苷A可能通過激活TGF/BMP通路，促進MC3T3-E1細胞的增殖、分化。

本實驗證明了酸棗仁皂苷A對MC3T3-E1細胞無明顯的毒性與抑制效果，而且能促進MC3T3-E1細胞增殖與在保證細胞在低營養(yǎng)環(huán)境下存活；通過Von kossa染色實驗、Elisa實驗與RT-qPCR實驗證明酸棗仁皂苷A促進MC3T3-E1細胞分化與成熟，并加快成骨細胞轉變?yōu)楣墙M織；最后通過蛋白質免疫印跡實驗揭示了酸棗仁皂苷A促進MC3T3-E1細胞增殖與分化的機制激活了細胞中TGF/BMP通路。但本實驗尚未進行動物體內實驗進行進一步驗證，且只針對單一信號通路進行研究，對酸棗仁皂苷A干預骨細胞與骨組織的機制還需設計實驗進行探討。

4 結論

酸棗仁皂苷A能促進MC3T3-E1成骨細胞增殖，減少細胞凋亡，提高細胞分化程度與成骨效率，其機制可能是通過調控TGF/BMP通路而發(fā)揮的。