鄔仁華 董猛 白娟 卿毅 李玲

(成都大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，四川 成都 610000)

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第五大癌癥，具有發(fā)病率高和死亡率高的特點(diǎn)，中國患者數(shù)量及死亡率均居世界之首[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，HCC患者5年生存率不足30%，盡管目前治療肝癌的方法較多，但效果并不盡人意[3-4]。因此，HCC的預(yù)防以及治療已成為癌癥研究的熱點(diǎn)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)許多中藥具有抗腫瘤的效果，不僅可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，同時(shí)還具有副作用小的特點(diǎn)[5-6]。淫羊藿是藥用價(jià)值極高的傳統(tǒng)植物中藥之一，具有抑菌、抗炎、抗腫瘤等諸多功效，其主要活性成分包含淫羊藿苷、淫羊藿素等[7]。其中，淫羊藿素被證實(shí)具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，且與腫瘤細(xì)胞的凋亡可能也存在一定關(guān)系，已被用于抗子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、肝癌等多方面的研究[8]。目前，有關(guān)淫羊藿素對人肝癌Hep-G2細(xì)胞抗增殖及凋亡的作用機(jī)制仍在討論中，為進(jìn)一步研究淫羊藿素調(diào)控人肝癌Hep-G2的惡性生物學(xué)特征，本研究觀察了淫羊藿素對人肝癌Hep-G2細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其對相關(guān)基因的影響，旨在探討其作用機(jī)制，以期為臨床治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞 Hep-G2細(xì)胞由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供。

1.2 主要試劑與儀器 淫羊藿素(CSA：5240-95-9；批號(hào)：20190108)購自寶雞市國康生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)所需青霉素購自哈藥集團(tuán)制藥總廠；培養(yǎng)基(名稱：RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng))購自自賽默飛世爾科技公司；Bcl-2抗體(貨號(hào)：sc-56015；批號(hào)：20190603)、Bax抗體(貨號(hào)：sc-70407；批號(hào)：20190606)購自Santa Cruze Biotechnology 公司；Ki67抗體(貨號(hào)：ab205718)購自Abcam中國公司；凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司；熒光分光光度計(jì)(型號(hào)：722)購自賽默飛公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Forma公司；臺(tái)式低溫離心機(jī)(型號(hào)：JIDI-16R)購自廣州激迪儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：NE-600)購自深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人肝癌Hep-G2細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中添加100 U/ml 青霉素和100 U/ml鏈霉素，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設(shè)置為37℃恒溫，調(diào)整CO2濃度為5%。

1.3.2 分組干預(yù) 將細(xì)胞分為：空白對照組，低、中、高劑量組，低、中、高劑量組分別使用2.5、5、10 μM/L的淫羊藿素處理。

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞的增殖情況[9]將各組對數(shù)生長期人肝癌Hep-G2細(xì)胞以5000個(gè)/空接種于96個(gè)孔板中，貼壁生長后分別用 0、0.05、0.5、5、50 μM/L的淫羊藿素RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入MTT溶液后使用DMSO溶解使用分光光度計(jì)檢測570 nm波長處的光密度值，并計(jì)算細(xì)胞的抑制率，抑制率(%)=[(1-藥物組A值)/空白對照組A值]×100%。

1.3.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 取上述培養(yǎng)的肝癌Hep-G2細(xì)胞，使用恒溫離心機(jī)在4℃的恒溫條件下離心10 min，加入裂解液后再加入Loading Buffer 緩沖液。測定蛋白濃度后，電泳提取總蛋白并將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜后加入一抗液中孵育過夜。加入Ki67(稀釋倍數(shù)1：500)、Bax (稀釋倍數(shù)1：500)、Bcl-2(稀釋倍數(shù)1：500)、Caspase-3(稀釋倍數(shù)1：500)；以β-actin (稀釋倍數(shù)1：1000)為內(nèi)參蛋白，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，依據(jù)相對灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測Hep-G2細(xì)胞增殖情況[10]取上述細(xì)胞，在每個(gè)孔板中加入2.6 mL溶液并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×103個(gè)/mL，十字輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞分散均勻。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周后使用結(jié)晶紫染色計(jì)算克隆形成率。克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/所種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測Hep-G2細(xì)胞凋亡情況[11]取上述細(xì)胞，4℃恒溫1000 r/min離心5 min，PBS洗滌2遍，棄上清液，加入試劑盒中的緩沖液混勻，再加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI混合，4℃避光孵育20 min，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行上樣檢測，CellQuest軟件分析計(jì)算Hep-G2細(xì)胞凋亡率。避光孵育15 min后上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果 當(dāng)使用淫羊藿素劑量為0.05 μM/L時(shí)候抑制率為4.00%；當(dāng)使用淫羊藿素劑量為0.5 μM/L時(shí)候抑制率增加至13.00%(P<0.05)；當(dāng)使用淫羊藿素劑量為5 μM/L時(shí)候抑制率增加至48.30%(P<0.05)；當(dāng)使用淫羊藿素劑量為50 μM/L時(shí)候抑制率增加至89.50%(P<0.05)，見圖1。

2.2 相關(guān)增殖蛋白表達(dá)情況 與空白對照組相比，低劑量組Ki-67蛋白相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與低劑量組相比，中劑量組Ki-67蛋白相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組Ki-67蛋白相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖2。

2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況 由克隆形成實(shí)驗(yàn)可以看出，與空白對照組克隆形成率[(78.00±6. .00)%]相比，低劑量組克隆形成率[(60.50±4.05)%]顯著降低(P<0.05)；與低劑量組相比，中劑量組克隆形成率[(43.50±2.00)%]顯著降低(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組克隆形成率[(20.00±2.00)%]顯著降低(P<0.05)，見圖3。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 由流式細(xì)胞儀檢測肝癌細(xì)胞凋亡情況可以看出，相比空白組細(xì)胞凋亡率(8.90±9.00)%，低劑量組細(xì)胞凋亡率[(24.60±4.90)%]顯著上升(P<0.05)；相比低劑量組，中劑量組細(xì)胞凋亡率[(52.39±6.00)%]顯著上升(P<0.05)；相比中劑量組，高劑量組細(xì)胞凋亡率[(79.36±10.00)%]顯著上升至(P<0.05)，見圖4。

2.5 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 由蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)可以看出，與空白對照組相比，低劑量組促凋亡蛋白Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與低劑量組相比，中劑量組中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3相對表達(dá)水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組促凋亡蛋白Bax、Caspase-3相對表達(dá)水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖5。

3 討論

肝癌是臨床較為常見的腫瘤之一，起病隱匿，早期并無典型臨床癥狀，但發(fā)病后病情進(jìn)展迅速，對患者的生命安全造成巨大威脅[12]。盡管隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，肝癌的診斷及治療手段已取得一定進(jìn)展，但仍有部分患者的臨床結(jié)局較差。因此，對肝癌患者死亡率的控制仍然是醫(yī)學(xué)工作中的一個(gè)難點(diǎn)，探索新的治療藥物有重要的積極意義。

近年來，使用中藥治療肝癌具有較好的效果。淫羊藿是傳統(tǒng)中藥中的一味補(bǔ)益藥材，其作為傳統(tǒng)中藥用于治療各類疾病已有悠久歷史。早期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿具有保護(hù)心腦血管、提高人體免疫力、促進(jìn)骨代謝等功能，近年來有學(xué)者報(bào)道，其除了在內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)方面發(fā)揮效用外，還具有抗腫瘤作用[13]?，F(xiàn)代藥理研究表明[14]，淫羊藿中的一種重要活性成分——淫羊藿，能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，因此被認(rèn)為是一種具有廣泛應(yīng)用前景的抗癌藥物之一。

腫瘤細(xì)胞的惡性增殖是腫瘤發(fā)展的重要因素之一。張淑琴等[15]比較了淫羊藿素抑制人腎癌細(xì)胞786-O、人肺癌細(xì)胞A549及人肝癌細(xì)胞HepG2共3種腫瘤細(xì)胞增殖的效果，發(fā)現(xiàn)其對上述3種腫瘤細(xì)胞的增殖均有明顯抑制作用。本研究通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用淫羊藿素可以有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖，且隨著使用濃度的升高其抑制效果顯著增強(qiáng)，這與張淑琴等[15]的研究結(jié)論類似。使用淫羊藿素對肝癌細(xì)胞的半數(shù)致死濃度(IC50)為5.38 μM/L。本實(shí)驗(yàn)選取0、0.5、5、10 μM/L四個(gè)濃度用于后續(xù)對HepG2細(xì)胞增殖、凋亡表達(dá)影響的探討。通過克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，當(dāng)使用不同濃度的淫羊藿素溶液處理HepG2細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞克隆形成率出現(xiàn)明顯下降，且克隆形成率隨淫羊藿素溶液的增大而下降，提示淫羊藿素對于HepG2細(xì)胞的增殖能力具有良好的抑制作用，這與本研究中此前的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果所對應(yīng)。同時(shí)，本研究進(jìn)一步通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測了增殖相關(guān)蛋白Ki-67的表達(dá)水平。Ki-67是常見的調(diào)控細(xì)胞增殖的蛋白之一，既往文獻(xiàn)顯示，其表達(dá)水平與增殖能力呈正相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，使用淫羊藿素處理后肝癌細(xì)胞的增殖受到了顯著抑制，說明淫羊藿素可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖。黃佳彬[17]研究表明，淫羊藿素能夠通過調(diào)控有絲分裂的相關(guān)蛋白使肝癌Hep G2細(xì)胞S期被阻滯，這可能是淫羊藿素抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。

本研究通過Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，當(dāng)使用淫羊藿素溶液處理HepG2細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著增高，提示淫羊藿素可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡是其重要的生物學(xué)特征，這種生物學(xué)特征收到相關(guān)蛋白的調(diào)控目前研究較多的包括Bcl-2家族和Caspase家族[18-19]。李晶等[20]研究表明，淫羊藿素可以調(diào)控活化型肝星狀細(xì)胞系HSC-T6(大鼠)中Bax及Caspase-3的表達(dá)，調(diào)控HSC-T6細(xì)胞的凋亡。本研究在人肝癌HepG2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論，相比空白對照組，使用淫羊藿素處理后的各組肝癌細(xì)胞Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平顯著降低。這說明淫羊藿素可以有效抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并促進(jìn)凋亡蛋白Bax的表達(dá)，激活Caspase家族的凋亡啟動(dòng)子Caspase-3，從而促進(jìn)人肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié)論

淫羊藿素可以抑制肝癌Hep-G2細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2蛋白和上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)以及增強(qiáng)caspase-3的活性相關(guān)。