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        β-谷甾醇緩解LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠炎癥反應(yīng)和纖維化*

        2022-06-20 07:39:16周強張坤李富強劉偉王鑫
        西部醫(yī)學(xué) 2022年6期
        關(guān)鍵詞:肺泡纖維化誘導(dǎo)

        周強 張坤 李富強 劉偉 王鑫

        (1. 邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲 056001;2. 陽信縣中醫(yī)院,山東 濱州 251800;3. 濱州市第二人民醫(yī)院,山東 濱州 256800)

        急性肺損傷是常見的危重疾病之一,具有較高的致殘率和病死率,隨著人口老齡化問題、環(huán)境污染的加劇,急性肺損傷的發(fā)病率也逐漸升高,嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1]。盡管抗微生物治療和支持治療取得了長足的進步,但急性肺損傷仍缺乏有效的治療手段[2]。目前,急性肺損傷的發(fā)病機制尚不完全清楚,但普遍認(rèn)為炎癥反應(yīng)和纖維化在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中有重要作用,因此,基于炎癥反應(yīng)和纖維化,探索急性肺損傷的治療藥物具有指導(dǎo)性意義[3-4]。β-谷甾醇(β-sitosterol)屬于四環(huán)三萜類化合物,具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種生理活性[5-6]。Zhou等[7]研究顯示,β-sitosterol可阻斷RIG-1和IFN/STAT信號,改善甲型流感病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷。但β-sitosterol在急性肺損傷中是否還有其他生物效用仍不清楚,故本研究建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型,觀察不同劑量β-sitosterol處理對急性肺損傷大鼠炎癥反應(yīng)和纖維化的影響,旨在為急性肺損傷的臨床治療提供新思路。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 試驗動物 清潔級、健康、雄性SD大鼠60只,6~8周齡,體質(zhì)量200~240 g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK (京)2019-0013,本研究已通過動物倫理委員會批準(zhǔn)。

        1.1.2 藥品與主要試劑 β-sitosterol、LPS、TUNEL試劑盒(美國Promega)、白細(xì)胞介素(IL-1β、IL-4、IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)、天狼星紅染液(武漢博士德生物工程有限公司)、Ki67、半胱天冬酶3(Caspase-3,Cas-3)、切割后cas-3(cleaved Cas-3)、iNOS、IL-4、α-平滑肌蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)及纖維連接蛋白(FN)單克隆抗體(美國Abcam)。

        1.2 方法

        1.2.1 急性肺損傷模型的構(gòu)建 腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,于頸部正中切口,分離皮下組織,充分暴露氣管,沿近心端刺入氣管,注入5 mg/kg LPS構(gòu)建急性肺損傷模型,參考文獻標(biāo)準(zhǔn)判斷造模是否成功[8]。

        1.2.2 動物分組、給藥與樣本采集 將60只SD大鼠隨機分為五組:健康對照組、模型組、模型+β-sitosterol組(5、10、20 mg/kg),每組12只。模型組和模型+β-sitosterol組采用LPS法構(gòu)建急性肺損傷模型,健康對照組以等體積生理鹽水替代。建模成功后,模型+β-sitosterol組分別灌胃5、10、20 mg/kg β-sitosterol[9],1次/d,連續(xù)灌胃14 d,健康對照組和模型組以等體積生理鹽水替代。給藥結(jié)束后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動脈取血,3000 r/m離心10 min,分離上層血清凍存于-80℃冰箱。斷頸法處死大鼠,快速分離肺組織,部分固定于4%多聚甲醛,剩余凍存液氮罐。

        1.2.3 肺組織TUNEL染色觀察 取固定肺組織,制備石蠟切片(8 μm),滴加蛋白酶K工作液孵育15 min,再添加封閉液室溫下孵育10 min,封閉內(nèi)源性過氧化酶,滴加TdT酶反應(yīng)液,37℃反應(yīng)60 min,接著滴加Streptavidin-HRP工作液,37℃反應(yīng)30 min,然后滴加DAB工作液顯色反應(yīng)10 min,0.5%甲基綠復(fù)染10 min,光鏡下觀察并拍照,胞核呈棕黃色指示為凋亡細(xì)胞。

        1.2.4 外周血炎性因子含量的檢測 取血清樣品和ELISA試劑,室溫下平衡溫度后,參照試劑盒說明書操作,檢測血清IL-1β、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS的含量。

        1.2.5 肺組織天狼星紅染色觀察 取固定肺組織,制備石蠟切片(8 μm),進行常規(guī)天狼星紅染色(天狼星紅染色60 min,再添加Mater蘇木素染色45 s),光鏡下觀察肺組織病理變化和膠原分布情況。

        1.2.6 肺組織western blotting檢測 取凍存肺組織提取總蛋白,經(jīng)BCA法定量檢測后,與5×上樣緩沖液混勻,沸水浴中變性5 min,配制10%分離膠+5%濃縮膠,取50 μg蛋白上樣電泳分離,再濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,取出PVDF膜浸沒于含有5%脫脂奶粉的封閉液中,室溫下輕搖2 h,再孵育蛋白一抗(稀釋比為1:1000),4℃下輕搖過夜,接著孵育蛋白二抗(稀釋比為1:10000),37℃下輕搖1 h,最后添加ECL化學(xué)發(fā)光、膠片曝光。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示Ki67、iNOS、IL-4、α-SMA、TGF-β及FN蛋白的相對表達量,以cleaved Cas-3/Cas-3比值表示活化Cas-3水平。

        1.2.7 肺組織RT-PCR檢測 取凍存肺組織提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再進行熒光實時定量PCR擴增,反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性60 s,60℃退火30 s,72℃延伸2 min,共40個循環(huán)。各基因引物序列[10]見表1,以GADPH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法,計算iNOS和IL-4 mRNA的相對表達量。

        表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequence

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠肺組織TUNEL染色結(jié)果的比較 光鏡下,健康對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄、間隔正常,肺組織內(nèi)幾乎沒有凋亡細(xì)胞;模型組大鼠肺泡間隔增厚、結(jié)構(gòu)紊亂,并伴有大量凋亡細(xì)胞;β-sitosterol組也存在肺泡間隔增厚、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,但10、20 mg/kg β-sitosterol組肺泡間隔增厚、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂程度輕于模型組,凋亡細(xì)胞數(shù)少于模型組。見圖1。

        2.2 各組大鼠肺組織中Ki67和Caspase-3表達的比較 與健康對照組比較,模型組肺組織中Ki67蛋白的相對表達量下調(diào),cleaved Cas-3/Cas-3水平上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,10、20 mg/kg β-sitosterol組Ki67蛋白的相對表達量上調(diào),cleaved Cas-3/Cas-3水平下調(diào)(均P<0.05)。見圖2。

        2.3 各組大鼠炎性因子水平的比較 與健康對照組比較,模型組外周血IL-1β、TNF-α、iNOS、IL-4、IL-10、肺組織中iNOS、IL-4 mRNA及蛋白的表達均上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,10、20 mg/kg β-sitosterol組外周血IL-1β、TNF-α、iNOS、肺組織中iNOS mRNA及蛋白的表達均下調(diào),外周血IL-4、IL-10、肺組織中IL-4 mRNA及蛋白的表達均上調(diào)(P<0.05)。見圖3、圖4。

        2.4 各組大鼠肺組織天狼星紅染色結(jié)果的比較 光鏡下,健康對照組肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,肺泡間隔均勻,無纖維化現(xiàn)象;模型組肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡壁增厚(纖維病變后加粗),伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤;10、20 mg/kg β-sitosterol組上述病變較模型組明顯減輕。見圖5。

        2.5 各組大鼠肺組織纖維化標(biāo)記物表達水平的比較 與健康對照組比較,模型組肺組織中α-SMA、TGF-β及FN蛋白的相對表達量均上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,10、20 mg/kg β-sitosterol組α-SMA、TGF-β及FN蛋白的相對表達量均下調(diào)(P<0.05)。見圖6。

        3 討論

        天然的植物甾醇及相關(guān)化合物約有250種,可從玉米、大豆等植物中提取,具有較高的營養(yǎng)價值,其中β-sitosterol的含量最為豐富,約占所有天然的植物甾醇的50%~65%[11-12]。β-sitosterol的藥理活性十分豐富,Rajavel等[13]研究顯示,β-sitosterol可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549的凋亡,可能通過靶向Trx/Trx1軸誘導(dǎo)活性氧的積累,損傷線粒體,激活p53的表達。Feng等[14]分析結(jié)果顯示,β-sitosterol可降低人體血漿膽固醇水平,預(yù)防非酒精性脂肪性肝病。嚴(yán)寧等[15]研究顯示,β-sitosterol可能參與ERK1/2信號通路,緩解心肌缺血再灌注大鼠出現(xiàn)的氧化應(yīng)激和炎癥損傷,并抑制心肌細(xì)胞的凋亡,從而保護大鼠心肌缺血再灌注損傷。Ilaria等[16]通過分離β-sitosterol處理囊性纖維化支氣管上皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)β-sitosterol可控制細(xì)胞中趨化細(xì)胞因子基因的表達,減輕過度的炎癥反應(yīng)。但β-sitosterol在急性肺損傷方面的研究仍處于起步階段。

        迄今為止,急性肺損傷的發(fā)病機制尚未完全明了,除了致病因素對肺泡-毛細(xì)血管屏障的直接損傷外,多種炎性細(xì)胞及因子介導(dǎo)的肺內(nèi)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)水腫、肺不張等實質(zhì)性損傷,直接影響肺功能,同時凝血系統(tǒng)紊亂、纖溶代謝失衡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、纖維化等會持續(xù)加重肺損傷,并形成惡性循環(huán)[17-19]。本研究結(jié)果顯示,與健康對照組比較,模型組大鼠肺組織中TUNEL陽性染色細(xì)胞數(shù)增多,活化的凋亡因子Cas-3水平提高,增殖細(xì)胞抗原Ki67表達降低,給予β-sitosterol處理后,凋亡細(xì)胞減少,Ki67表達上調(diào),cleaved Cas-3/Cas-3水平下調(diào),提示β-sitosterol可能通過上調(diào)Ki67、抑制凋亡因子Cas-3的活化,抑制急性肺損傷大鼠肺組織細(xì)胞的凋亡。這與Lin等[20]報道β-sitosterol在心肌缺血再灌注損傷中的抗凋亡作用相似。多項研究表明,β-sitosterol具有較高的抗炎活性[21-22],本研究中,β-sitosterol可有效降低急性肺損傷大鼠促炎因子IL-1β、TNF-α、iNOS水平,提高抑炎因子IL-4和IL-10水平,表明β-sitosterol在急性肺損傷中的抗炎作用,可能是其保護作用途徑之一。另外,Park等[23]研究指出,β-sitosterol可通過抑制TGF-β1/Snail途徑,抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而減輕肺纖維化。研究顯示,急性肺損傷后早期肺纖維化的發(fā)生與進展中,TGF-β有重要作用,LPS刺激提高TGF-β表達,進一步活化成纖維細(xì)胞,誘導(dǎo)多種促纖維化細(xì)胞因子的分泌(α-SMA等),導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(FN等)的過度累積[24-26]。本研究發(fā)現(xiàn),β-sitosterol可減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織纖維化程度,降低纖維化標(biāo)記物α-SMA、TGF-β及FN蛋白的表達,提示β-sitosterol在急性肺損傷中具有抗纖維化作用。

        4 結(jié)論

        β-sitosterol可改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷,可能為通過上調(diào)Ki67、抑制凋亡因子Cas-3的活化,抑制肺組織細(xì)胞凋亡;降低急性肺損傷大鼠促炎因子IL-1β、TNF-α、iNOS水平,提高抑炎因子IL-4和IL-10水平,降低炎癥反應(yīng);降低纖維化標(biāo)記物α-SMA、TGF-β及FN蛋白的表達,減輕纖維化。但β-sitosterol是否還有其他途徑作用于急性肺損傷,仍有待進一步深入研究。

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