周強(qiáng) 張坤 李富強(qiáng) 劉偉 王鑫

(1. 邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；2. 陽(yáng)信縣中醫(yī)院，山東 濱州 251800；3. 濱州市第二人民醫(yī)院，山東 濱州 256800)

急性肺損傷是常見(jiàn)的危重疾病之一，具有較高的致殘率和病死率，隨著人口老齡化問(wèn)題、環(huán)境污染的加劇，急性肺損傷的發(fā)病率也逐漸升高，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1]。盡管抗微生物治療和支持治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但急性肺損傷仍缺乏有效的治療手段[2]。目前，急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但普遍認(rèn)為炎癥反應(yīng)和纖維化在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，因此，基于炎癥反應(yīng)和纖維化，探索急性肺損傷的治療藥物具有指導(dǎo)性意義[3-4]。β-谷甾醇(β-sitosterol)屬于四環(huán)三萜類化合物，具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種生理活性[5-6]。Zhou等[7]研究顯示，β-sitosterol可阻斷RIG-1和IFN/STAT信號(hào)，改善甲型流感病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷。但β-sitosterol在急性肺損傷中是否還有其他生物效用仍不清楚，故本研究建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型，觀察不同劑量β-sitosterol處理對(duì)急性肺損傷大鼠炎癥反應(yīng)和纖維化的影響，旨在為急性肺損傷的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)、健康、雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量200～240 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK (京)2019-0013，本研究已通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥品與主要試劑 β-sitosterol、LPS、TUNEL試劑盒(美國(guó)Promega)、白細(xì)胞介素(IL-1β、IL-4、IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)、天狼星紅染液(武漢博士德生物工程有限公司)、Ki67、半胱天冬酶3(Caspase-3，Cas-3)、切割后cas-3(cleaved Cas-3)、iNOS、IL-4、α-平滑肌蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)及纖維連接蛋白(FN)單克隆抗體(美國(guó)Abcam)。

1.2 方法

1.2.1 急性肺損傷模型的構(gòu)建 腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，于頸部正中切口，分離皮下組織，充分暴露氣管，沿近心端刺入氣管，注入5 mg/kg LPS構(gòu)建急性肺損傷模型，參考文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)判斷造模是否成功[8]。

1.2.2 動(dòng)物分組、給藥與樣本采集 將60只SD大鼠隨機(jī)分為五組：健康對(duì)照組、模型組、模型+β-sitosterol組(5、10、20 mg/kg)，每組12只。模型組和模型+β-sitosterol組采用LPS法構(gòu)建急性肺損傷模型，健康對(duì)照組以等體積生理鹽水替代。建模成功后，模型+β-sitosterol組分別灌胃5、10、20 mg/kg β-sitosterol[9]，1次/d，連續(xù)灌胃14 d，健康對(duì)照組和模型組以等體積生理鹽水替代。給藥結(jié)束后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，3000 r/m離心10 min，分離上層血清凍存于-80℃冰箱。斷頸法處死大鼠，快速分離肺組織，部分固定于4%多聚甲醛，剩余凍存液氮罐。

1.2.3 肺組織TUNEL染色觀察 取固定肺組織，制備石蠟切片(8 μm)，滴加蛋白酶K工作液孵育15 min，再添加封閉液室溫下孵育10 min，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶，滴加TdT酶反應(yīng)液，37℃反應(yīng)60 min，接著滴加Streptavidin-HRP工作液，37℃反應(yīng)30 min，然后滴加DAB工作液顯色反應(yīng)10 min，0.5%甲基綠復(fù)染10 min，光鏡下觀察并拍照，胞核呈棕黃色指示為凋亡細(xì)胞。

1.2.4 外周血炎性因子含量的檢測(cè) 取血清樣品和ELISA試劑，室溫下平衡溫度后，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)血清IL-1β、IL-4、IL-10、TNF-α及iNOS的含量。

1.2.5 肺組織天狼星紅染色觀察 取固定肺組織，制備石蠟切片(8 μm)，進(jìn)行常規(guī)天狼星紅染色(天狼星紅染色60 min，再添加Mater蘇木素染色45 s)，光鏡下觀察肺組織病理變化和膠原分布情況。

1.2.6 肺組織western blotting檢測(cè) 取凍存肺組織提取總蛋白，經(jīng)BCA法定量檢測(cè)后，與5×上樣緩沖液混勻，沸水浴中變性5 min，配制10%分離膠+5%濃縮膠，取50 μg蛋白上樣電泳分離，再濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，取出PVDF膜浸沒(méi)于含有5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫下輕搖2 h，再孵育蛋白一抗(稀釋比為1：1000)，4℃下輕搖過(guò)夜，接著孵育蛋白二抗(稀釋比為1：10000)，37℃下輕搖1 h，最后添加ECL化學(xué)發(fā)光、膠片曝光。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示Ki67、iNOS、IL-4、α-SMA、TGF-β及FN蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以cleaved Cas-3/Cas-3比值表示活化Cas-3水平。

1.2.7 肺組織RT-PCR檢測(cè) 取凍存肺組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性60 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)。各基因引物序列[10]見(jiàn)表1，以GADPH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法，計(jì)算iNOS和IL-4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequence

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織TUNEL染色結(jié)果的比較 光鏡下，健康對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄、間隔正常，肺組織內(nèi)幾乎沒(méi)有凋亡細(xì)胞；模型組大鼠肺泡間隔增厚、結(jié)構(gòu)紊亂，并伴有大量凋亡細(xì)胞；β-sitosterol組也存在肺泡間隔增厚、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，但10、20 mg/kg β-sitosterol組肺泡間隔增厚、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂程度輕于模型組，凋亡細(xì)胞數(shù)少于模型組。見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠肺組織中Ki67和Caspase-3表達(dá)的比較 與健康對(duì)照組比較，模型組肺組織中Ki67蛋白的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，cleaved Cas-3/Cas-3水平上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，10、20 mg/kg β-sitosterol組Ki67蛋白的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，cleaved Cas-3/Cas-3水平下調(diào)(均P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 各組大鼠炎性因子水平的比較 與健康對(duì)照組比較，模型組外周血IL-1β、TNF-α、iNOS、IL-4、IL-10、肺組織中iNOS、IL-4 mRNA及蛋白的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，10、20 mg/kg β-sitosterol組外周血IL-1β、TNF-α、iNOS、肺組織中iNOS mRNA及蛋白的表達(dá)均下調(diào)，外周血IL-4、IL-10、肺組織中IL-4 mRNA及蛋白的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖3、圖4。

2.4 各組大鼠肺組織天狼星紅染色結(jié)果的比較 光鏡下，健康對(duì)照組肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔均勻，無(wú)纖維化現(xiàn)象；模型組肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁增厚(纖維病變后加粗)，伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；10、20 mg/kg β-sitosterol組上述病變較模型組明顯減輕。見(jiàn)圖5。

2.5 各組大鼠肺組織纖維化標(biāo)記物表達(dá)水平的比較 與健康對(duì)照組比較，模型組肺組織中α-SMA、TGF-β及FN蛋白的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，10、20 mg/kg β-sitosterol組α-SMA、TGF-β及FN蛋白的相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

3 討論

天然的植物甾醇及相關(guān)化合物約有250種，可從玉米、大豆等植物中提取，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其中β-sitosterol的含量最為豐富，約占所有天然的植物甾醇的50%～65%[11-12]。β-sitosterol的藥理活性十分豐富，Rajavel等[13]研究顯示，β-sitosterol可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549的凋亡，可能通過(guò)靶向Trx/Trx1軸誘導(dǎo)活性氧的積累，損傷線粒體，激活p53的表達(dá)。Feng等[14]分析結(jié)果顯示，β-sitosterol可降低人體血漿膽固醇水平，預(yù)防非酒精性脂肪性肝病。嚴(yán)寧等[15]研究顯示，β-sitosterol可能參與ERK1/2信號(hào)通路，緩解心肌缺血再灌注大鼠出現(xiàn)的氧化應(yīng)激和炎癥損傷，并抑制心肌細(xì)胞的凋亡，從而保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷。Ilaria等[16]通過(guò)分離β-sitosterol處理囊性纖維化支氣管上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)β-sitosterol可控制細(xì)胞中趨化細(xì)胞因子基因的表達(dá)，減輕過(guò)度的炎癥反應(yīng)。但β-sitosterol在急性肺損傷方面的研究仍處于起步階段。

迄今為止，急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，除了致病因素對(duì)肺泡-毛細(xì)血管屏障的直接損傷外，多種炎性細(xì)胞及因子介導(dǎo)的肺內(nèi)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)水腫、肺不張等實(shí)質(zhì)性損傷，直接影響肺功能，同時(shí)凝血系統(tǒng)紊亂、纖溶代謝失衡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、纖維化等會(huì)持續(xù)加重肺損傷，并形成惡性循環(huán)[17-19]。本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中TUNEL陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)增多，活化的凋亡因子Cas-3水平提高，增殖細(xì)胞抗原Ki67表達(dá)降低，給予β-sitosterol處理后，凋亡細(xì)胞減少，Ki67表達(dá)上調(diào)，cleaved Cas-3/Cas-3水平下調(diào)，提示β-sitosterol可能通過(guò)上調(diào)Ki67、抑制凋亡因子Cas-3的活化，抑制急性肺損傷大鼠肺組織細(xì)胞的凋亡。這與Lin等[20]報(bào)道β-sitosterol在心肌缺血再灌注損傷中的抗凋亡作用相似。多項(xiàng)研究表明，β-sitosterol具有較高的抗炎活性[21-22]，本研究中，β-sitosterol可有效降低急性肺損傷大鼠促炎因子IL-1β、TNF-α、iNOS水平，提高抑炎因子IL-4和IL-10水平，表明β-sitosterol在急性肺損傷中的抗炎作用，可能是其保護(hù)作用途徑之一。另外，Park等[23]研究指出，β-sitosterol可通過(guò)抑制TGF-β1/Snail途徑，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而減輕肺纖維化。研究顯示，急性肺損傷后早期肺纖維化的發(fā)生與進(jìn)展中，TGF-β有重要作用，LPS刺激提高TGF-β表達(dá)，進(jìn)一步活化成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)多種促纖維化細(xì)胞因子的分泌(α-SMA等)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(FN等)的過(guò)度累積[24-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，β-sitosterol可減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織纖維化程度，降低纖維化標(biāo)記物α-SMA、TGF-β及FN蛋白的表達(dá)，提示β-sitosterol在急性肺損傷中具有抗纖維化作用。

4 結(jié)論

β-sitosterol可改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，可能為通過(guò)上調(diào)Ki67、抑制凋亡因子Cas-3的活化，抑制肺組織細(xì)胞凋亡；降低急性肺損傷大鼠促炎因子IL-1β、TNF-α、iNOS水平，提高抑炎因子IL-4和IL-10水平，降低炎癥反應(yīng)；降低纖維化標(biāo)記物α-SMA、TGF-β及FN蛋白的表達(dá)，減輕纖維化。但β-sitosterol是否還有其他途徑作用于急性肺損傷，仍有待進(jìn)一步深入研究。