孫威 宮政 翟悅 袁媛媛

(沈陽市骨科醫(yī)院藥劑科，遼寧 沈陽110044)

腦血管疾病為臨床常見、多發(fā)疾病，其較高的致殘、致死率嚴(yán)重威脅人類生活質(zhì)量及生命健康[1]。臨床資料顯示，腦缺血起病急、進(jìn)展快，其卒中發(fā)病率占全部卒中發(fā)病率的75%以上，且呈年輕化趨勢[2]。資料[3]表明，腦缺血-再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，且多因素參與并涉及多個作用環(huán)節(jié)，其相互作用，引發(fā)系列級聯(lián)反應(yīng)。目前，臨床尚無特效治療藥物，因此尋找高效低毒的新藥仍作為腦神經(jīng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。隨研究深入發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀對腦CIRI具有一定保護(hù)作用，但臨床尚不清楚其防治CIRI的作用機(jī)制，且有關(guān)辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷研究報道較少[4-5]。本研究通過建立腦缺血再灌注損傷模型給予辛伐他汀干預(yù)，旨在探討其對腦缺血再灌注損傷的干預(yù)效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取40只健康SPF級SD雄性大鼠，體重210～239 g，平均體重(224.5±12.3)g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司(合格證號：SCXK 魯20130001)提供。實(shí)驗(yàn)動物于術(shù)前自由飲食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境恒溫濕度45%～55%，溫度(20.54±2.00)℃，12 h循環(huán)光照，維持基礎(chǔ)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，本研究所選取大鼠處理方法均符合動物倫理處置要求，且本研究獲我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 動物模型制備及分組 參照Longa等[6]研究中大腦中動脈栓塞再灌注模型制備方法，并進(jìn)行改良。手術(shù)前夜禁食，采用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定，在頸部作一正中切口，分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈。于總動脈開口處將預(yù)先處理好的尼龍線(長4 cm，線直徑0.26～0.28 mm，頭端直徑0.36 mm)緩慢插入頸內(nèi)動脈入顱方向，以頸總動脈分叉處為標(biāo)記，插入深度1.8～2.1 mm稍感阻力停止，阻斷大腦中動脈所有血液供應(yīng)，實(shí)現(xiàn)右側(cè)大腦中動脈栓塞缺血，2 h后退出線栓是大腦中動脈再通，實(shí)現(xiàn)大腦中動脈的缺血后再灌注。注意術(shù)中室溫嚴(yán)格控制在23℃～25℃。建模過程中死亡3只，成功27只，隨機(jī)分為模型組、小劑量組、高劑量組，每組9只，對各組大鼠分別進(jìn)行干預(yù)，參考人與動物體表面積等效劑量比值，計(jì)算大鼠給藥劑量，以1/2等效劑量為小劑量，2倍為高劑量，小、高劑量組大鼠分別尾部靜脈注射20 mg/kg、40 mg/kg辛伐他汀，正常組、模型組大鼠給予等劑量生理鹽水干預(yù)。

1.3 標(biāo)本采集、HE染色 干預(yù)1周后對大鼠行麻醉處理，斷頭法處死，取出腦組織，剪取部分腦組織制備勻漿液。取大鼠海馬區(qū)腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，完全浸泡，5%酸鈉脫鈣處理，24 h后常規(guī)包埋、切片處理，以不同濃度酒精進(jìn)行復(fù)水。蘇木精染色15 min，后以1%伊紅染色，封片處理后以顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.4 指標(biāo)評估

1.4.1 腦組織含水量、腦梗死體積、神經(jīng)功能損傷程度評估 腦組織含水量：再灌注72 h后將大鼠處死，取出梗死側(cè)大腦半球，稱重腦組織濕重后置于100℃烤盤內(nèi)烘烤至恒重，后稱量腦組織干重。腦組織含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。腦梗死體積：每組隨機(jī)選取6只大鼠麻醉處死，將腦組織切成2.0 mm切片并浸入2% TTC內(nèi)30 min，將染色處理腦梗死組織呈灰白色，正常腦組織呈玫瑰紅色。將切片于4%多聚甲醛內(nèi)固定，以Image J圖像分析系統(tǒng)計(jì)算腦梗死體積。腦梗死體積百分比=(正常側(cè)半球體積-梗死側(cè)肺梗死去大腦半球體積半球面積)/正常側(cè)大腦半球體積。神經(jīng)功能損傷程度：采用改良Lon-ga五點(diǎn)量表評分系統(tǒng)對大鼠神經(jīng)功能損傷進(jìn)行評估。0分無神經(jīng)功能障礙；1分為尾巴提起后向?qū)?cè)前肢屈曲；2分為行走時原地打轉(zhuǎn)，靜止時身體未偏向?qū)?cè)；3分為行走時實(shí)原地打轉(zhuǎn)，靜止時身體偏向?qū)?cè)；4分為嚴(yán)重意識障礙，無法自發(fā)行走。

1.4.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 備圓形水池，直徑150 cm、高50 cm，分別標(biāo)記4個點(diǎn)位，注入半池水，水溫27℃。在水池中央放入一個高30 cm、直徑10 cm平臺。于再灌注第5 d開始實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行5 d。前4 d將大鼠面朝水池內(nèi)壁放于水中，并開始攝像記錄。大鼠找到站臺并停留30 s，若找不到站臺則用引導(dǎo)棒引導(dǎo)至站臺停留30 s。將大鼠移出，30 s將大鼠以同樣方式放入另一個象限，直至4個象限全部完成。記錄潛伏期(找到站臺時間)。第5 d撤除平臺，記錄大鼠在60 s內(nèi)第三象限活動時間及穿越站臺次數(shù)。潛伏期越短，第三象限活動時間和穿越次數(shù)越多，表明大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力越強(qiáng)。

1.4.3 雙抗體夾心ELISA法檢測腦組織勻漿液白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平各組細(xì)胞置于室溫后，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，然后取出試劑盒(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，按照1：2比例稀釋樣品；于每孔內(nèi)加入100 μL已稀釋好的待測血清和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；后以專用的洗滌液重復(fù)洗滌反應(yīng)板，再加入1：100稀釋的抗體工作液100 μL/孔，37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入IL-1β、TNF-α、hs-CRP、GSH-Px、SOD、MDA溶液100 μL/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100 μL/孔終止反應(yīng)，分別用酶標(biāo)儀在450 nm波長測定IL-1β、TNF-α、hs-CRP、SOD水平，340 nm波長測定GSH-Px含量，532 nm波長測定MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織病理圖 正常組：腦組織結(jié)構(gòu)完好，細(xì)胞核清晰可見；模型組：存在明顯炎性細(xì)胞浸潤情況；小劑量組：可見炎性細(xì)胞浸潤情況，腦組織結(jié)構(gòu)較為完整；高劑量組：炎性細(xì)胞親潤情況相對較輕，細(xì)胞排列較為規(guī)則。見圖1。

2.2 各組大鼠腦組織含水量、腦梗死體積、神經(jīng)功能損傷評估 相比正常組，模型組大鼠腦組織含水量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相比模型組，小劑量組、高劑量組大鼠組織含水量、腦梗死面積、神經(jīng)功能損傷評分較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組大鼠腦組織含水量及神經(jīng)功能損傷評估

2.3 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力評估 與正常組相比，模型組、小、高劑量組大鼠各時間點(diǎn)躲避潛伏期較長，第三象限活動時間、穿越站臺次數(shù)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；相比模型組、小劑量組，高劑量組大鼠各時間點(diǎn)躲避潛伏期較低，第三象限活動時間、穿越站臺次數(shù)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。 見表3。

表3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)Table 3 Morris water maze test

2.4 各組炎性因子水平比較 與正常組相比，模型組大鼠IL-1β、TNF-α、hs-CRP水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；相比模型組、小劑量組，高劑量組大鼠IL-1β、TNF-α、hs-CRP水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表4。

表4 各組炎性因子水平比較Table 4 Comparison of inflammatory factors in each group

2.5 GSH-Px、SOD、MDA水平比較 與正常組相比，模型組大鼠GSH-Px、SOD水平較低，MDA水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；相比模型組、小劑量組，高劑量組大鼠GSH-Px、SOD水平升高，MDA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表5。

表5 GSH-Px、SOD、MDA水平比較Table 5 Comparison of GSH Px，SOD and MDA levels

3 討論

臨床實(shí)踐證實(shí)，腦缺血再灌注損傷作為影響治療效果的重要危險因素，與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及興奮性氨基酸毒性等多種機(jī)制相關(guān)。相關(guān)學(xué)者指出，腦缺血再灌注的主要治病機(jī)制與炎性反應(yīng)與氧化損傷的發(fā)生密不可分[7-8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能及認(rèn)知能力。研究指出，辛伐他汀憑借良好抗炎、抗氧化效果被廣泛應(yīng)用于腦缺血性疾病中，對改善神經(jīng)功能損傷、降低短暫性缺血及卒中的死亡率具有重要意義[9-12]。楊曉煒等[13]研究中證實(shí)，他汀類藥物可改善大鼠腦缺血再灌注損傷，減輕神經(jīng)損傷程度，提高認(rèn)知能力。本研究結(jié)果顯示，以辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷大鼠進(jìn)行干預(yù)，大鼠神經(jīng)功能損傷、梗死體積降低、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)潛伏期降低、活動時間及平臺穿越次數(shù)增加，形成此結(jié)果的原因可能與辛伐他汀良好的神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)。由此得出，辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷具有良好的干預(yù)效果。

本文研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可有效抑制腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生的炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究表明，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中扮演重要角色[14-16]。IL-1β、TNF-α、hs-CRP等作為典型炎性因子，其異常表達(dá)激活大量炎癥介質(zhì)，使得炎癥反應(yīng)加重造成腦組織損傷、壞死，形成梗死灶。而血清hs-CRP更被認(rèn)為是缺血再灌注損傷發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)[17-18]。相關(guān)研究[19-20]證實(shí)，TNF-α、hs-CRP參與大鼠腦缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展。通過給予阿托伐他汀干預(yù)，TNF-α、hs-CRP水平降低，且隨劑量增加對炎癥的抑制作用升高，與本文研究內(nèi)容相符，但因干預(yù)措施、樣本納入量不同等因素影響，研究結(jié)果可能存在一定偏倚。腦梗死發(fā)生后細(xì)胞、自由基等發(fā)生系列病理生理變化，加重功能損傷[21-23]。研究證實(shí)，腦組織在氧化應(yīng)激條件下受到抗氧化酶保護(hù)，有效清除有害自由基。自由基在缺氧缺血狀態(tài)下的生成速度超過機(jī)體清除速度造成氧化應(yīng)激損傷[24-25]。本研究結(jié)果顯示，通過辛伐他汀干預(yù)腦缺血再灌注損傷大鼠，IL-1β、TNF-α、hs-CRP、MDA水平降低，GSH-Px、SOD水平升高，提示辛伐他汀可有效抑制腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生的炎性、氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮良好的抗炎、抗過氧化作用。由此得出，辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用可能與影響、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。

4 結(jié)論

辛伐他汀能夠減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，縮小梗死面積，提高神經(jīng)功能，形成這種保護(hù)作用可能與抑制炎癥和抗過氧化損傷相關(guān)，為抗腦缺血再灌注損傷藥物研究提供重要理論依據(jù)。但本研究樣本量較小、觀察時間有限，未對不同再灌注時間及藥物使用劑量進(jìn)行研究，需進(jìn)一步增加樣本量對干預(yù)效果進(jìn)行深入研究。