孫威 宮政 翟悅 袁媛媛
(沈陽市骨科醫(yī)院藥劑科,遼寧 沈陽110044)
腦血管疾病為臨床常見、多發(fā)疾病,其較高的致殘、致死率嚴重威脅人類生活質(zhì)量及生命健康[1]。臨床資料顯示,腦缺血起病急、進展快,其卒中發(fā)病率占全部卒中發(fā)病率的75%以上,且呈年輕化趨勢[2]。資料[3]表明,腦缺血-再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)發(fā)病機制較為復(fù)雜,且多因素參與并涉及多個作用環(huán)節(jié),其相互作用,引發(fā)系列級聯(lián)反應(yīng)。目前,臨床尚無特效治療藥物,因此尋找高效低毒的新藥仍作為腦神經(jīng)領(lǐng)域的研究熱點。隨研究深入發(fā)現(xiàn),辛伐他汀對腦CIRI具有一定保護作用,但臨床尚不清楚其防治CIRI的作用機制,且有關(guān)辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷研究報道較少[4-5]。本研究通過建立腦缺血再灌注損傷模型給予辛伐他汀干預(yù),旨在探討其對腦缺血再灌注損傷的干預(yù)效果及作用機制。
1.1 實驗材料 選取40只健康SPF級SD雄性大鼠,體重210~239 g,平均體重(224.5±12.3)g,由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司(合格證號:SCXK 魯20130001)提供。實驗動物于術(shù)前自由飲食、飲水,飼養(yǎng)環(huán)境恒溫濕度45%~55%,溫度(20.54±2.00)℃,12 h循環(huán)光照,維持基礎(chǔ)狀態(tài)。實驗結(jié)束后,本研究所選取大鼠處理方法均符合動物倫理處置要求,且本研究獲我院倫理委員會批準(zhǔn)。
1.2 動物模型制備及分組 參照Longa等[6]研究中大腦中動脈栓塞再灌注模型制備方法,并進行改良。手術(shù)前夜禁食,采用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,仰臥固定,在頸部作一正中切口,分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈,結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈。于總動脈開口處將預(yù)先處理好的尼龍線(長4 cm,線直徑0.26~0.28 mm,頭端直徑0.36 mm)緩慢插入頸內(nèi)動脈入顱方向,以頸總動脈分叉處為標(biāo)記,插入深度1.8~2.1 mm稍感阻力停止,阻斷大腦中動脈所有血液供應(yīng),實現(xiàn)右側(cè)大腦中動脈栓塞缺血,2 h后退出線栓是大腦中動脈再通,實現(xiàn)大腦中動脈的缺血后再灌注。注意術(shù)中室溫嚴格控制在23℃~25℃。建模過程中死亡3只,成功27只,隨機分為模型組、小劑量組、高劑量組,每組9只,對各組大鼠分別進行干預(yù),參考人與動物體表面積等效劑量比值,計算大鼠給藥劑量,以1/2等效劑量為小劑量,2倍為高劑量,小、高劑量組大鼠分別尾部靜脈注射20 mg/kg、40 mg/kg辛伐他汀,正常組、模型組大鼠給予等劑量生理鹽水干預(yù)。
1.3 標(biāo)本采集、HE染色 干預(yù)1周后對大鼠行麻醉處理,斷頭法處死,取出腦組織,剪取部分腦組織制備勻漿液。取大鼠海馬區(qū)腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定,完全浸泡,5%酸鈉脫鈣處理,24 h后常規(guī)包埋、切片處理,以不同濃度酒精進行復(fù)水。蘇木精染色15 min,后以1%伊紅染色,封片處理后以顯微鏡進行觀察。
1.4 指標(biāo)評估
1.4.1 腦組織含水量、腦梗死體積、神經(jīng)功能損傷程度評估 腦組織含水量:再灌注72 h后將大鼠處死,取出梗死側(cè)大腦半球,稱重腦組織濕重后置于100℃烤盤內(nèi)烘烤至恒重,后稱量腦組織干重。腦組織含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。腦梗死體積:每組隨機選取6只大鼠麻醉處死,將腦組織切成2.0 mm切片并浸入2% TTC內(nèi)30 min,將染色處理腦梗死組織呈灰白色,正常腦組織呈玫瑰紅色。將切片于4%多聚甲醛內(nèi)固定,以Image J圖像分析系統(tǒng)計算腦梗死體積。腦梗死體積百分比=(正常側(cè)半球體積-梗死側(cè)肺梗死去大腦半球體積半球面積)/正常側(cè)大腦半球體積。神經(jīng)功能損傷程度:采用改良Lon-ga五點量表評分系統(tǒng)對大鼠神經(jīng)功能損傷進行評估。0分無神經(jīng)功能障礙;1分為尾巴提起后向?qū)?cè)前肢屈曲;2分為行走時原地打轉(zhuǎn),靜止時身體未偏向?qū)?cè);3分為行走時實原地打轉(zhuǎn),靜止時身體偏向?qū)?cè);4分為嚴重意識障礙,無法自發(fā)行走。
1.4.2 Morris水迷宮實驗 備圓形水池,直徑150 cm、高50 cm,分別標(biāo)記4個點位,注入半池水,水溫27℃。在水池中央放入一個高30 cm、直徑10 cm平臺。于再灌注第5 d開始實驗,共進行5 d。前4 d將大鼠面朝水池內(nèi)壁放于水中,并開始攝像記錄。大鼠找到站臺并停留30 s,若找不到站臺則用引導(dǎo)棒引導(dǎo)至站臺停留30 s。將大鼠移出,30 s將大鼠以同樣方式放入另一個象限,直至4個象限全部完成。記錄潛伏期(找到站臺時間)。第5 d撤除平臺,記錄大鼠在60 s內(nèi)第三象限活動時間及穿越站臺次數(shù)。潛伏期越短,第三象限活動時間和穿越次數(shù)越多,表明大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力越強。
1.4.3 雙抗體夾心ELISA法檢測腦組織勻漿液白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平各組細胞置于室溫后,標(biāo)記酶標(biāo)板,制作標(biāo)準(zhǔn)品,然后取出試劑盒(賽默飛世爾科技(中國)有限公司),按照1:2比例稀釋樣品;于每孔內(nèi)加入100 μL已稀釋好的待測血清和標(biāo)準(zhǔn)品,37℃恒溫孵育箱中濕育2 h;后以專用的洗滌液重復(fù)洗滌反應(yīng)板,再加入1:100稀釋的抗體工作液100 μL/孔,37℃恒溫孵育箱中濕育45 min;繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后,在反應(yīng)孔內(nèi)加入IL-1β、TNF-α、hs-CRP、GSH-Px、SOD、MDA溶液100 μL/孔,置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100 μL/孔終止反應(yīng),分別用酶標(biāo)儀在450 nm波長測定IL-1β、TNF-α、hs-CRP、SOD水平,340 nm波長測定GSH-Px含量,532 nm波長測定MDA含量。
2.1 大鼠腦組織病理圖 正常組:腦組織結(jié)構(gòu)完好,細胞核清晰可見;模型組:存在明顯炎性細胞浸潤情況;小劑量組:可見炎性細胞浸潤情況,腦組織結(jié)構(gòu)較為完整;高劑量組:炎性細胞親潤情況相對較輕,細胞排列較為規(guī)則。見圖1。
2.2 各組大鼠腦組織含水量、腦梗死體積、神經(jīng)功能損傷評估 相比正常組,模型組大鼠腦組織含水量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);相比模型組,小劑量組、高劑量組大鼠組織含水量、腦梗死面積、神經(jīng)功能損傷評分較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2、圖2。
表2 各組大鼠腦組織含水量及神經(jīng)功能損傷評估
2.3 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力評估 與正常組相比,模型組、小、高劑量組大鼠各時間點躲避潛伏期較長,第三象限活動時間、穿越站臺次數(shù)較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);相比模型組、小劑量組,高劑量組大鼠各時間點躲避潛伏期較低,第三象限活動時間、穿越站臺次數(shù)較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。 見表3。
表3 Morris水迷宮實驗Table 3 Morris water maze test
2.4 各組炎性因子水平比較 與正常組相比,模型組大鼠IL-1β、TNF-α、hs-CRP水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);相比模型組、小劑量組,高劑量組大鼠IL-1β、TNF-α、hs-CRP水平較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表4。
表4 各組炎性因子水平比較Table 4 Comparison of inflammatory factors in each group
2.5 GSH-Px、SOD、MDA水平比較 與正常組相比,模型組大鼠GSH-Px、SOD水平較低,MDA水平較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);相比模型組、小劑量組,高劑量組大鼠GSH-Px、SOD水平升高,MDA水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表5。
表5 GSH-Px、SOD、MDA水平比較Table 5 Comparison of GSH Px,SOD and MDA levels
臨床實踐證實,腦缺血再灌注損傷作為影響治療效果的重要危險因素,與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及興奮性氨基酸毒性等多種機制相關(guān)。相關(guān)學(xué)者指出,腦缺血再灌注的主要治病機制與炎性反應(yīng)與氧化損傷的發(fā)生密不可分[7-8]。
本研究發(fā)現(xiàn),辛伐他汀可改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能及認知能力。研究指出,辛伐他汀憑借良好抗炎、抗氧化效果被廣泛應(yīng)用于腦缺血性疾病中,對改善神經(jīng)功能損傷、降低短暫性缺血及卒中的死亡率具有重要意義[9-12]。楊曉煒等[13]研究中證實,他汀類藥物可改善大鼠腦缺血再灌注損傷,減輕神經(jīng)損傷程度,提高認知能力。本研究結(jié)果顯示,以辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷大鼠進行干預(yù),大鼠神經(jīng)功能損傷、梗死體積降低、Morris水迷宮實驗潛伏期降低、活動時間及平臺穿越次數(shù)增加,形成此結(jié)果的原因可能與辛伐他汀良好的神經(jīng)保護作用相關(guān)。由此得出,辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷具有良好的干預(yù)效果。
本文研究發(fā)現(xiàn),辛伐他汀可有效抑制腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生的炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究表明,炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中扮演重要角色[14-16]。IL-1β、TNF-α、hs-CRP等作為典型炎性因子,其異常表達激活大量炎癥介質(zhì),使得炎癥反應(yīng)加重造成腦組織損傷、壞死,形成梗死灶。而血清hs-CRP更被認為是缺血再灌注損傷發(fā)生的獨立預(yù)測指標(biāo)[17-18]。相關(guān)研究[19-20]證實,TNF-α、hs-CRP參與大鼠腦缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展。通過給予阿托伐他汀干預(yù),TNF-α、hs-CRP水平降低,且隨劑量增加對炎癥的抑制作用升高,與本文研究內(nèi)容相符,但因干預(yù)措施、樣本納入量不同等因素影響,研究結(jié)果可能存在一定偏倚。腦梗死發(fā)生后細胞、自由基等發(fā)生系列病理生理變化,加重功能損傷[21-23]。研究證實,腦組織在氧化應(yīng)激條件下受到抗氧化酶保護,有效清除有害自由基。自由基在缺氧缺血狀態(tài)下的生成速度超過機體清除速度造成氧化應(yīng)激損傷[24-25]。本研究結(jié)果顯示,通過辛伐他汀干預(yù)腦缺血再灌注損傷大鼠,IL-1β、TNF-α、hs-CRP、MDA水平降低,GSH-Px、SOD水平升高,提示辛伐他汀可有效抑制腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生的炎性、氧化應(yīng)激反應(yīng),發(fā)揮良好的抗炎、抗過氧化作用。由此得出,辛伐他汀對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用可能與影響、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。
辛伐他汀能夠減輕大鼠腦缺血再灌注損傷,縮小梗死面積,提高神經(jīng)功能,形成這種保護作用可能與抑制炎癥和抗過氧化損傷相關(guān),為抗腦缺血再灌注損傷藥物研究提供重要理論依據(jù)。但本研究樣本量較小、觀察時間有限,未對不同再灌注時間及藥物使用劑量進行研究,需進一步增加樣本量對干預(yù)效果進行深入研究。