陳文兵 田新 吳登攀 鐘振國 黃金蘭

(1. 徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 南寧 530200)

老年癡呆(Senile dementia，SD)是老年期發(fā)生的以記憶障礙、失語、失認(rèn)、失用和行為改變?yōu)橹饕R床特征的一類疾病，包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、血管性癡呆(Vascular dementia，VD)，混合型癡呆(Mixed dementia)和其他類型癡呆(Other dementia)，其中AD是該類疾病的主要類型[1-4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為SD是多因素引起的一種原發(fā)性大腦神經(jīng)退行性病變，患者海馬神經(jīng)元缺失而認(rèn)知能力下降。 PI3K/Akt是抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活的重要信號(hào)通路，激活PI3K/Akt信號(hào)通路可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5-6]。PLCγ1被認(rèn)為是一個(gè)與細(xì)胞增殖和分化有重要關(guān)系的分子，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，PLCγ1催化分解的1，2一二酞基甘油(DAG)產(chǎn)物可激活PKC，PKC活化與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)有密切關(guān)系[7]。三七總皂苷(PNS)是三七的活性成分，前期研究顯示PNS具有明顯改善快速老化癡呆模型小鼠SAMP8(以下簡稱SAMP8)的學(xué)習(xí)記憶能力[8]，然而，其機(jī)制尚不清楚。本研究擬探討PNS對(duì)PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信號(hào)通路的影響，以期為PNS治療SD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取3月齡雄性SAMP8 30只，體重20～30 g；SAMR1小鼠(與SAMP8同一來源陰性鼠，3月齡)10只，均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK (京)2014-004]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房內(nèi)。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Light Cycle 480熒光定量 PCR 儀(Roche公司)；NanoDrop 1000核酸濃度測(cè)定儀(Thermo Scientific 公司)；Elx 808酶標(biāo)儀(BioTek公司)；VE 180 Tanon 垂直電泳系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；V37掃描儀(EPSON 公司)；BX43F正置熒光顯微鏡(OLYMPUS 公司)。生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、包埋機(jī)、切片機(jī)(金華科迪儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品與主要試劑 三七總皂苷(PNS，云南云科藥業(yè)有限公司，批號(hào)：140115)；IRDye 800CW goat anti-rabbit TgG (Li-cor公司，貨號(hào)：926-32211)；ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo公司，貨號(hào)：FSQ-101)；TRIzol? Reagent (Life Technologies公司，貨號(hào)：15596-026)；PI3K抗體(Santa Cruz公司，貨號(hào)：sc-292114)；p-Akt抗體(Cell Signaling 公司，貨號(hào)：4060S)；Akt抗體( Cell Signaling 公司，貨號(hào)：4691S)；β-actin 抗體(Bioworld 公司，貨號(hào)：AP0060)；p-PLCγ1抗體(Cell Signaling 公司，貨號(hào)：14008S)；PLCγ1抗體(Cell Signaling 公司，貨號(hào)：5690S)；尼氏(Nissl)染色液(Beyotime，C0117)；PKC Kinase Activity Assay Kit (abcam公司，貨號(hào)：ab139437)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組與給藥 SAMP8小鼠隨機(jī)分為模型組、PNS高劑量組(200 mg·kg-1)和PNS低劑量組(100 mg·kg-1)，每組10只。藥物組每日給予藥物灌胃一次，對(duì)照組(SAMR1組)和模型組每日給予相同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥2個(gè)月。

1.4.2 尼氏染色法觀察海馬形態(tài) 大腦組織灌注后浸于4%多聚甲醛48 h，脫水、石蠟包埋，切片常規(guī)脫蠟至水化，置入尼氏染色液10 min，自來水沖洗，二甲苯透明，中性樹膠封片。染色切片在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍片，觀察海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)。

1.4.3 酶活性試劑盒檢測(cè)PKC的活性 采用 Kinase Activity Assay Kit試劑盒檢測(cè)大腦PKC的活性，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。取新鮮大腦組織，加入RIPA裂解液于冰上充分裂解后，低溫離心取上清，BCA法檢測(cè)樣本的蛋白濃度。PKC 孔板每孔加入50 μL 激酶溶液，放置10 min后棄液，每孔加入含2 ug樣本質(zhì)量的激酶溶液，再加入10 μL/孔ATP，封膜30℃恒溫孵育90 min。棄液，加入40 μL/孔磷酸化底物抗體常溫孵育60 min后，洗滌4次，加入40 μL/孔辣根過氧化物常溫孵育30 min后再洗滌4次，加入60 μL/孔TMB底物常溫孵育50 min后加入終止液，于450 nm波長處測(cè)定各孔的吸光度，按公式計(jì)算PKC活性。蛋白激酶C的相對(duì)活性=(樣本吸光度-空白吸光度)/ 每孔蛋白質(zhì)量。

1.4.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠腦內(nèi)PI3K、Akt、 PLCγ1和PKC mRNA的含量 采用TRIzol法提取小鼠大腦的RNA，檢測(cè)其濃度和純度。按逆轉(zhuǎn)錄說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。根據(jù)小鼠PI3K、Akt 、PLCγ1和PKC基因序列，由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成上、下游引物序列(見表1)。在Roche LightCycler? 96熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以ACTB為內(nèi)參，按 2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.5 免疫印跡法測(cè)定PI3K，p-Akt (Ser473)、Akt、p-PLCγ1 (Tyr783)和 PLCγ1 蛋白的表達(dá)水平 大腦組織加入適量裂解液，冰浴電動(dòng)勻漿，4℃，12000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣本經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、5%BSA封閉后，加入一抗(PI3K：1：500，p-Akt：1：2000，Akt：1：1000，p-PLCγ1：1：1000，PLCγ1：1：1000，β-actin：1：2000)4℃搖床上孵育過夜，次日加入熒光二抗(1：10000)孵育1 h，TBS清洗后EPSON掃描儀掃描圖像，用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)觀察 尼氏小體在光學(xué)顯微鏡下為嗜堿性深染的顆?；蛐K，分布于神經(jīng)元胞體和樹突中。經(jīng)尼氏染色后呈藍(lán)紫色。尼氏小體大而數(shù)量多，說明神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng)；相反在神經(jīng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，尼氏小體的數(shù)量會(huì)減少甚至消失。對(duì)照鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量多，結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)整，尼氏小體染色均一，SAMP8海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量減少，排列紊亂，形態(tài)不規(guī)整，有斷層，尼氏小體細(xì)胞數(shù)量明顯減少。PNS給藥組CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊形態(tài)正常，尼氏著色較均一且數(shù)量明顯增多。見圖1。

2.2 PNS對(duì)SAMP8腦內(nèi)PKC活性的影響 與對(duì)照組比較，模型組的 PKC活性有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，PNS低、高劑量組的 PKC活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果提示，PNS可以提高SAMP8小鼠大腦PKC活性。見圖2。

2.3 PNS對(duì)SAMP8腦內(nèi)PI3K、Akt、PLCγ1和PKC mRNA的含量的影響 與對(duì)照組相比，模型組的PI3K、Akt 和PKC mRNA的含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，PNS高、低劑量組的PI3K、Akt mRNA表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)；PNS高劑量組PLCγ1和PKC mRNA表達(dá)水平亦顯著增高(P<0.05)。提示PNS可提高SAMP8小鼠腦內(nèi)PI3K/Akt通路及PLCγ1/PKC通路基因表達(dá)。見圖3。

2.4 PNS對(duì)SAMP8腦內(nèi)PI3K，p-Akt (Ser473)、Akt、p-PLCγ1 (Tyr783)和 PLCγ1 蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織PI3K、p-Akt 和p-PLCγ1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，PNS高、低劑量組上調(diào)SAMP8 小鼠腦組織PI3K、p-Akt和 p-PLCγ1蛋白表達(dá)(P<0.01)；各給藥組小鼠腦組織Akt和PLCγ1總蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，PNS可激活PI3K/Akt通路及PLCγ1通路。見圖4～6。

3 討論

SD的主要特征是進(jìn)行性記憶和學(xué)習(xí)功能障礙。海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與學(xué)習(xí)記憶和情緒功能密切聯(lián)系的腦區(qū)，海馬神經(jīng)元的損傷可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[9-13]。前期研究已經(jīng)證實(shí)，PNS可以改善SAMP8小鼠的行為記憶能力[8]。然而PNS對(duì)SD神經(jīng)元損傷的影響及其機(jī)制目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，PNS可顯著減輕SAMP8小鼠神經(jīng)元損傷，該作用可能與PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信號(hào)通路有關(guān)。

尼氏小體是合成更新細(xì)胞器所必需的結(jié)構(gòu)蛋白及合成神經(jīng)遞質(zhì)所必需的酶類，可作為神經(jīng)元功能狀態(tài)的標(biāo)志。當(dāng)神經(jīng)元受損時(shí)，尼氏小體數(shù)目減少、解體甚至消失[14-19]。因此尼氏染色是神經(jīng)元特異染色實(shí)驗(yàn)方法。由本實(shí)驗(yàn)的尼氏染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊，尼氏小體數(shù)量多，染色均一，模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列紊亂，有斷裂，尼氏染色不均一，而PNS給藥后，CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)均有不同程度的恢復(fù)，尼氏小體數(shù)量增加，著色均一，這說明PNS可以減輕SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元的損傷。

AD是SD的主要類型。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是參與細(xì)胞凋亡過程的經(jīng)典信號(hào)通路，PI3K/Akt信號(hào)通路及其調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)與AD病人細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系[20-23]。研究報(bào)道Aβ可以通過抑制PI3K/Akt信號(hào)途徑而減輕神經(jīng)元損傷，并改善動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶障礙[24]。PLCγ1被各種細(xì)胞因子激活水解產(chǎn)生肌醇3磷酸和甘油二酯兩種胞內(nèi)產(chǎn)物，甘油二酯可激活PKC，從而發(fā)揮抗凋亡作用而促進(jìn)細(xì)胞存活[25]。PLCγ1和PKC在AD患者腦內(nèi)表達(dá)降低。因此，PLCγ1/PKC信號(hào)通路可能在AD細(xì)胞凋亡中發(fā)揮調(diào)控作用。為了探討PNS對(duì)PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信號(hào)通路的影響，本研究主要從基因和蛋白水平上檢測(cè)了PI3K/Akt和PLCγ1/PKC相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示，模型組SAMP8腦內(nèi)PI3K、p-Akt、p-PLCγ1 蛋白表達(dá)明顯下降，而PNS均能不同程度的提高PI3K、Akt 、PLCγ1和PKC mRNA含量和上調(diào)PI3K、p-Akt 和p-PLCγ1蛋白表達(dá)。這提示PNS抑制神經(jīng)元損傷可能與其激活PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信號(hào)通路有關(guān)。

4 結(jié)論

PNS可以減輕SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元的損傷，這可能與其激活PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信號(hào)通路有關(guān)。