孟 青，崔曉燕，周林濤，顏慧敏，姜含芳，葉炳均，陳虹宇，孫麗芳，陳運(yùn)生

繼20世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，抗生素的使用一直是臨床細(xì)菌感染性疾病治療的首選方案，但近年來(lái)隨著細(xì)菌耐藥形勢(shì)日益嚴(yán)峻，耐藥菌感染病治療可選用的抗生素捉襟見(jiàn)肘。為規(guī)范兒童患者抗生素的合理使用，給臨床治療提供參考依據(jù)，現(xiàn)將2018—2020年深圳市兒童醫(yī)院臨床分離菌株分布和耐藥情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種收集 收集2018年1月—2020年12月我院每天臨床送檢標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性的臨床分離株；剔除同一患者重復(fù)的同種分離株及除無(wú)菌體液（如腦脊液、血液）外檢出的草綠色鏈球菌和凝固酶陰性葡萄球菌。

1.1.2 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定 標(biāo)本采集、培養(yǎng)及菌株鑒定參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[1]，采用法國(guó)梅里埃公司的VITEK 2-Compact自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和VITEK MS自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)及常規(guī)血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.1.3 藥敏試驗(yàn)材料 藥敏紙片均購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。肺炎鏈球菌測(cè)定使用鄭州安圖生物生產(chǎn)的E試驗(yàn)條。VITEK 2-Compact自動(dòng)藥敏分析系統(tǒng)使用配套GN13、GN334、GN335、GP67、GP639和GP68藥敏卡。卡他莫拉菌用Mueller-Hinton瓊脂、肺炎鏈球菌青霉素E試驗(yàn)條和草綠色鏈球菌用含5%脫纖維羊血MH瓊脂、流感嗜血桿菌用HTM瓊脂，均購(gòu)自廣州迪景公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 對(duì)肺炎鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、葡萄球菌、腸桿菌目細(xì)菌及不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌的藥敏試驗(yàn)采用自動(dòng)化儀器法，對(duì)儀器法折點(diǎn)不覆蓋的抗菌藥物使用紙片擴(kuò)散法或E試驗(yàn)法進(jìn)行補(bǔ)充，包括流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌和草綠色鏈球菌。按CLSI標(biāo)準(zhǔn)[2-3]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及結(jié)果判讀，按美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)[4]判讀替加環(huán)素藥敏試驗(yàn)結(jié)果，頭孢哌酮-舒巴坦結(jié)果參照頭孢哌酮折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)判讀。質(zhì)控菌株為：金黃色葡萄球菌ATCC 25923（紙片法）和ATCC 29213（儀器法）、大腸埃希菌ATCC 25922和ATCC 35218、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎鏈球菌ATCC 49619、 流感嗜血桿菌ATCC 49247、 流感嗜血桿菌ATCC 49766、糞腸球菌ATCC 29212和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.2.2 β內(nèi)酰胺酶檢測(cè) 超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）的檢測(cè)使用自動(dòng)化儀器法；使用頭孢硝噻吩紙片檢測(cè)嗜血桿菌屬和卡他莫拉菌的β內(nèi)酰胺酶。

1.2.3 肺炎鏈球菌對(duì)青霉素耐藥性檢測(cè) 經(jīng)苯唑西林紙片法測(cè)定抑菌圈直徑≤19 mm的肺炎鏈球菌，采用青霉素E試驗(yàn)條測(cè)定其MIC。

1.2.4 特殊耐藥菌的定義 碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌（CRE）為對(duì)亞胺培南、美羅培南或厄他培南中任一藥物耐藥者[5]。其中摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅維登斯菌屬需對(duì)除亞胺培南外的碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用WHONET 5.6軟件。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分布

2018—2020年我院共分離臨床菌株21 925株，其中門(mén)急診患者分離菌株1 687株（7.7%），住院患者分離菌株20 238株（92.3%）。革蘭陰性菌 13 522株（61.7%），革蘭陽(yáng)性菌8 403株（38.3%）。標(biāo)本來(lái)源中呼吸道占68.1 %、尿液6.9 %、血液6.0%、膿液6.3 %、糞便5.7 %和其他標(biāo)本6.9%。

三年中臨床分離菌中數(shù)量最多的前五位細(xì)菌依次為肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌。腸桿菌目細(xì)菌共檢出4 084株（占總分離菌株的18.6%），其中最多見(jiàn)者依次為大腸埃希菌（49.0%，2 000株）、沙門(mén)菌屬（27.4%，1 119株）和肺炎克雷伯菌（12.7%，519株）。不發(fā)酵糖革蘭陰性菌共檢出949株（占總分離菌株的4.3%），其中最常見(jiàn)的是銅綠假單胞菌（65.5%，622株）和鮑曼不動(dòng)桿菌（17.4%，165株）。主要細(xì)菌分布見(jiàn)表1。

表1 2018—2020年分離細(xì)菌種類(lèi)及數(shù)量分布Table 1 Distribution of clinical isolates by species from 2018 to 2020[n（%）]

2.2 革蘭陽(yáng)性菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 鏈球菌屬

2.2.1.1 肺炎鏈球菌 4 796株肺炎鏈球菌中，4株為腦膜炎分離株，包括3株青霉素耐藥株（PRSP），1株青霉素敏感株（PSSP）。4 792株非腦膜炎分離株中無(wú)PRSP株，青霉素中介株（PISP）的檢出率三年分別為0.3%、0.1%和0.6%，PSSP檢出率均＞99%。未發(fā)現(xiàn)青霉素、莫西沙星、厄他培南、萬(wàn)古霉素和利奈唑胺耐藥株；已發(fā)現(xiàn)對(duì)氟喹諾酮類(lèi)的耐藥株。見(jiàn)表2。

表2 非腦膜炎肺炎鏈球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 2 Susceptibility of non-meningitis S. pneumoniae to antimicrobial agents（%）

2.2.1.2 無(wú)乳鏈球菌和草綠色鏈球菌 無(wú)乳鏈球菌對(duì)青霉素均敏感，草綠色鏈球菌對(duì)青霉素和頭孢曲松的耐藥率分別為25.8%和30.8%，兩種細(xì)菌中均未檢出利奈唑胺或萬(wàn)古霉素耐藥株。見(jiàn)表3。

表3 無(wú)乳鏈球菌和草綠色鏈球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of S. agalactiae and S. viridans isolates to antimicrobial agents（%）

2.2.2 葡萄球菌屬 金黃色葡萄球菌中MRSA的檢出率三年分別為35.4%、32.8%和26.2%，凝固酶陰性葡萄球菌中MRCNS的檢出率分別為83.2%、83.2%和68.3%。葡萄球菌屬中未分離到對(duì)萬(wàn)古霉素或利奈唑胺耐藥株，三年中對(duì)紅霉素耐藥、克林霉素敏感或中介的金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌各檢出159、155、125株和197、201、93株，其中D試驗(yàn)陽(yáng)性比例分別為90.8%、89.9%、92.6%和52.7%、54.3%、53.8%。見(jiàn)表4。

表4 葡萄球菌屬對(duì)抗菌藥物的耐藥率Table 4 Resistance rates of Staphylococcus strains to antimicrobial agents（%）

2.2.3 腸球菌屬 535株腸球菌屬中，糞腸球菌和屎腸球菌分別為251株（46.9%）和211株（39.4%）。糞腸球菌對(duì)除利奈唑胺外的其他受試抗菌藥物的耐藥率均低于屎腸球菌。兩菌中均未分離到萬(wàn)古霉素耐藥株，分離到利奈唑胺耐藥的糞腸球菌2株（采用E試驗(yàn)法復(fù)核，MIC值均為8 mg/L）。見(jiàn)表5。

表5 糞腸球菌和屎腸球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 5 Susceptibility of E. faecalis and E. faecium to antimicrobial agents（%）

2.3 革蘭陰性菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 常見(jiàn)腸桿菌目細(xì)菌

2.3.1.1 大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌 大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中產(chǎn)ESBL菌株三年檢出率分別為39.6%、35.9%、36.9%和33.5%、31.8%、29.3%，CRE菌株檢出率分別為0.6%、0.3%、0.3%和3.2%、6.2%、4.5%。大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)除頭孢呋辛、頭孢曲松和甲氧芐啶-磺胺甲唑外的其他受試藥物的耐藥率均＜30%。見(jiàn)表6。

表6 大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 6 Susceptibility of E. coli and K. pneumoniae to antimicrobial agents（%）

2.3.1.2 沙門(mén)菌屬 沙門(mén)菌屬1 119株，其中傷寒沙門(mén)菌和乙型副傷寒沙門(mén)菌各3株。鼠傷寒沙門(mén)菌（590株，占52.7%）和腸炎沙門(mén)菌（152株，占13.6%）是最為常見(jiàn)的菌種。沙門(mén)菌屬對(duì)阿莫西林-克拉維酸和左氧氟沙星的耐藥率均＜10%。但鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林、頭孢曲松和甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率均高于腸炎沙門(mén)菌。見(jiàn)表7。

表7 沙門(mén)菌屬對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 7 Susceptibility of Salmonella species to antimicrobial agents（%）

2.3.1.3 其他腸桿菌目細(xì)菌 變形菌屬、腸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯菌和枸櫞酸桿菌屬細(xì)菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥特點(diǎn)不一，耐藥率亦不一樣。腸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯菌和枸櫞酸桿菌屬中CRE的檢出率分別為11.9%、13.4%和2.2%。變形桿菌屬細(xì)菌對(duì)亞胺培南的耐藥率為25.4%，但對(duì)厄他培南100%敏感，無(wú)CRE菌株。見(jiàn)表8。

表8 其他腸桿菌目細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 8 Susceptibility of other Enterobacterales to antimicrobial agents（%）

2.3.2 不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌 銅綠假單胞菌對(duì)受試藥物耐藥率均較低（＜10%），鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)受試藥物的耐藥率均＜40%；碳青霉烯類(lèi)耐藥的銅綠假單胞菌（CRPA）和鮑曼不動(dòng)桿菌（CRAB）的三年檢出率分別為6.3%、7.1%、9.5%和10.4%、6.3%、16.0%，兩菌中均未分離到黏菌素耐藥株。69株嗜麥芽窄食單胞菌對(duì)受試藥物的耐藥率均＜30%。13株洋蔥伯克霍爾德菌對(duì)受試藥物均敏感。見(jiàn)表9。

表9 不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 9 Susceptibility of non-glucose-fermenting Gram-negative bacilli to antimicrobial agents（%）

2.3.3 其他革蘭陰性菌 流感嗜血桿菌產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的檢出率三年分別為51.7%、58.9%、47.7%；卡他莫拉菌產(chǎn)酶株檢出率均在97.6%～98.2%。已發(fā)現(xiàn)β內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥的流感嗜血桿菌（BLNAR），三年中檢出率分別為12.8%、14.1%、17.8%，未發(fā)現(xiàn)左氧氟沙星耐藥株。未分離到卡他莫拉菌對(duì)阿莫西林-克拉維酸耐藥株。見(jiàn)表10。

表10 卡他莫拉菌和流感嗜血桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 10 Susceptibility of M. catarrhalis and H. influenzae to antimicrobial agents in terms of β-lactamase production（%）

3 討論

2017年 我 院 臨 床 分 離 菌 株10 487株[6]，2018—2020年的臨床分離菌株逐年下降，其中呼吸道分離株中最常見(jiàn)的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌下降明顯，孫志豪等[7]報(bào)道東莞市流感嗜血桿菌的檢出率在2月份開(kāi)始逐漸上升并在5月份達(dá)到高峰，推測(cè)可能由于本地區(qū)2020年流感嗜血桿菌流行的時(shí)間同2019冠狀病毒病疫情的流行時(shí)間重合，由于疫情相關(guān)防控措施的提升，使我院2020年分離的流感嗜血桿菌數(shù)量明顯降低，具體原因有待進(jìn)一步研究。

三年中肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的不敏感率均保持較低水平（0.1%～0.6%），低于全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)（CARSS）2018年（6.6%）和2019年（6.3%）[8]及CHINET 2018年（10.6%）和2019年（4.8%）的報(bào)道[9-10]，對(duì)紅霉素（98.1%～99.0%）和克林霉素（96.3%～98.0%）耐藥率略高于CARSS 2018年（95.4%和89.3%）和2019年（95.6%和91.4%）報(bào)道[8]。金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌中MRSA和MRCNS的檢出率2018—2020年呈下降趨勢(shì)，與CARSS報(bào)道[8]一致。腸球菌屬中屎腸球菌對(duì)多數(shù)受試抗菌藥物的耐藥率均高于糞腸球菌，而近幾年出現(xiàn)少量耐利奈唑胺的糞腸球菌，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，應(yīng)密切關(guān)注。化膿鏈球菌是兒童猩紅熱常見(jiàn)病原菌，可導(dǎo)致腎小球腎炎[12]，由于在化膿鏈球菌中尚未發(fā)現(xiàn)青霉素或氨芐西林非敏感株，故參照CLSI M100推薦未能常規(guī)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[2]。無(wú)乳鏈球菌為新生兒產(chǎn)褥熱常見(jiàn)病原體，可導(dǎo)致新生兒敗血癥和細(xì)菌性腦膜 炎[13]，監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示無(wú)乳鏈球菌未檢出青霉素耐藥株，對(duì)紅霉素和克林霉素耐藥率分別為73.9%和46.8%，與CHINET 2018年（91.3%和76.2%）和2019年（86.9%和61.6%）報(bào)道相似[9-10]。而草綠色鏈球菌對(duì)青霉素和頭孢曲松耐藥率高于CHINET 2018年（25.8%和30.8%對(duì)8.5%和11.5%）和2019年（8.4%和11.1%）報(bào)道[9-10]。

2019年美國(guó)CDC發(fā)布的抗生素耐藥威脅報(bào) 告[14]，將CRE和CRAB列為緊急威脅，將CRPA列為嚴(yán)重威脅。我院的碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）由2017年的2.7%升至2019年的6.2%，2020年稍降至4.5%，腸桿菌屬和產(chǎn)氣克雷伯菌中CRE的檢出率均＞10%。CRPA和CRAB分別由2017年的1.5%和4.7%[6]增加至2020年的9.5%和16.0%。由于CRE對(duì)多種抗生素耐藥率均較高、感染死亡率高、且可由定植轉(zhuǎn)為感染[15-17]，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)開(kāi)展CRE定植人群的篩查和鑒別CRE的酶型[18-19]，以便臨床加強(qiáng)耐藥菌的院感防控和合理使用抗生素，以遏制CRE檢出率緩慢上升的趨勢(shì)。

我院監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示沙門(mén)菌屬中最常見(jiàn)的鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)受試藥物耐藥率均高于腸炎沙門(mén)菌，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]，CLSI M100規(guī)定對(duì)于糞便分離的沙門(mén)菌僅測(cè)試氨芐西林、甲氧芐啶-磺胺甲唑和一種氟喹諾酮類(lèi)藥物[2]，而在兒科患者中氟喹諾酮類(lèi)藥物使用受限，且鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林和甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率較高，但對(duì)阿莫西林-克拉維酸的耐藥率較低，提示可作為初始的經(jīng)驗(yàn)治療選擇。

卡他莫拉菌對(duì)β內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥的主要機(jī)制是產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶[21]，監(jiān)測(cè)顯示其未檢出阿莫西林-克拉維酸耐藥株。流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶和編碼青霉素結(jié)合蛋白3的ftsI基因突變導(dǎo)致的親和力下降[22]，本組資料顯示三年中流感嗜血桿菌中β內(nèi)酰胺酶的檢出率均在50%左右，其中產(chǎn)酶菌株對(duì)氨芐西林、阿奇霉素和甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率高于不產(chǎn)酶株。BLNAR的檢出率呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)。

隨著抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，臨床應(yīng)采取多學(xué)科合作，堅(jiān)持病原學(xué)診斷，依據(jù)藥敏結(jié)果和抗菌藥物的藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)合理選擇和使用，同時(shí)加強(qiáng)醫(yī)院感染的監(jiān)測(cè)和防控，多管齊下，延緩細(xì)菌耐藥進(jìn)一步發(fā)展。