曹雯雯，劉 欣，楊 陽(yáng)

結(jié)核病是一種慢性傳染性疾病，是由結(jié)核分枝桿菌感染引起，致死率較高。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，每年有1 000萬(wàn)結(jié)核病新發(fā)病例，且近年來(lái)發(fā)病率持續(xù)上升[1]。我國(guó)是結(jié)核病高發(fā)區(qū)，發(fā)病人數(shù)在世界范圍內(nèi)排名靠前，嚴(yán)重威脅人類生命健康安全。臨床上可將結(jié)核病分為活動(dòng)性結(jié)核和潛伏性結(jié)核[2]?；顒?dòng)性肺結(jié)核初期患者主要有發(fā)熱、咯痰等癥狀，臨床特征并不明顯，容易導(dǎo)致誤診。當(dāng)出現(xiàn)咳嗽、咯血等特征時(shí)患者已進(jìn)入中晚期，如無(wú)法及時(shí)診斷肺結(jié)核，可能會(huì)延誤結(jié)核病的最佳治療時(shí)機(jī)。因此，如何早期發(fā)現(xiàn)潛在的活動(dòng)性肺結(jié)核患者是結(jié)核病防治的重點(diǎn)[3]。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）是以T細(xì)胞免疫應(yīng)答作為基礎(chǔ)的γ干擾素釋放試驗(yàn)，用于結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)和結(jié)核病的輔助診斷[4]。胸腔積液生化指標(biāo)檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核患者的明確診斷具有至關(guān)重要的作用，其腺苷脫氨酶（ADA）作為鑒別結(jié)核性與惡性胸腔積液重要指標(biāo)之一，是目前性價(jià)比較高的診斷手段[5]。單一指標(biāo)診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的準(zhǔn)確度較低，且存在標(biāo)本污染等問(wèn)題，因此，尋找靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度較高的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)活動(dòng)性結(jié)核的診斷具有重要臨床價(jià)值。蔣鵬[6]研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)ADA和乳酸脫氫酶（LDH）對(duì)結(jié)核性胸腔積液具有較高診斷價(jià)值，本研究擬探討T-SPOT.TB聯(lián)合胸腔積液ADA檢測(cè)對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核患者的診斷價(jià)值，以期尋找契合度和準(zhǔn)確度高的診斷 方案。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年1月—2018年6月在山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院（原泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）就診的有肺部病灶伴胸腔積液患者201例，患者年齡在30～70歲，平均（46.5±8.7）歲，其中男136例，女65例?；颊呷朐汉缶?jīng)超聲、計(jì)算機(jī)斷層攝影（CT）檢查證實(shí)存在胸腔積液。所有患者均經(jīng)影像學(xué)檢查、痰結(jié)核分枝桿菌DNA、痰涂片檢查進(jìn)行診斷，根據(jù)診斷結(jié)果將患者分為活動(dòng)性肺結(jié)核組（76例）和非結(jié)核組（125例）。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，入選人員對(duì)研究?jī)?nèi)容完全了解，所有患者及其家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 活動(dòng)性肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]

①X線檢查肺部有空洞、增殖性病變、滲出性病變、干酪性病變；②病原菌陽(yáng)性患者，正在治療且未完成規(guī)定療程的患者；③病原菌陰性患者，抗結(jié)核治療＜3個(gè)月，或病原菌陽(yáng)性患者，中斷治療＜2個(gè)月，初治者治療＜5個(gè)月，復(fù)治者治療＜6個(gè)月。此次痰結(jié)核菌檢查陰性，且符合上述情況之一者為活動(dòng)性肺結(jié)核。

1.3 研究方法

外周血T-SPOT.TB檢測(cè)：檢測(cè)工具采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的配套儀器，于患者入院后第2天清晨，無(wú)需空腹，采取6～8 mL外周全血，用肝素鈉抗凝處理，保存于18～25℃，24 h內(nèi)采用T-SPOT.TB試劑盒（英國(guó)Oxford Immunotec公司）完成檢測(cè)。TB-Ab檢測(cè)：應(yīng)用免疫金標(biāo)本技術(shù)檢測(cè)血清中結(jié)核分枝桿菌IgG抗體。結(jié)核菌素（PPD）試驗(yàn)：取0.1 mL結(jié)核菌素稀釋液，于患者左前臂掌側(cè)中下部1/3交界處予以皮內(nèi)注射，形成6～10 mm大小的皮丘；2～3 d后測(cè)量形成的硬結(jié)直徑，判斷診斷結(jié)果。試驗(yàn)前需向患者說(shuō)明試驗(yàn)原理并征求其同意。

取每例患者治療前首次獲得的胸腔積液60 mL，其中將10 mL胸腔積液分別置于2個(gè)肝素抗凝管中，采用全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman公司）檢測(cè)其總蛋白水平；LDH、ADA試劑盒（美國(guó)羅氏公司）分別檢測(cè)其LDH、ADA水平；另外50 mL胸腔積液中加入0.2 mL的2 500 U肝素抗凝，采用T-SPOT.TB試劑盒檢測(cè)T-SPOT.TB水平。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)。

T-SPOT.TB檢測(cè)步驟：①胸腔積液T-SPOT.TB的檢測(cè)，胸腔積液經(jīng)700×g離心7 min后去除上清液，RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸沉淀物，采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞；按照說(shuō)明書(shū)，每個(gè)患者樣本設(shè)置4個(gè)檢測(cè)孔，在包被有小鼠抗人γ干擾素單抗的微孔培養(yǎng)板的4個(gè)檢測(cè)孔中分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液（陰性對(duì)照孔）、早期分泌靶向抗原6（抗原A）、培養(yǎng)濾過(guò)蛋白10（抗原B）和植物血凝素（陽(yáng)性對(duì)照孔）；將制備的單個(gè)核細(xì)胞分別加入到上述4孔中，加細(xì)胞終止液孵育16～20 h；棄去細(xì)胞液，PBS洗滌，加經(jīng)PBS稀釋的酶標(biāo)抗體工作液孵育1 h，棄去酶標(biāo)抗體工作液，加底物顯色溶液顯色；去離子水洗滌培養(yǎng)板終止反應(yīng)，晾干后采用酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀觀察每孔斑點(diǎn)數(shù)（細(xì)胞數(shù)）。②外周血T-SPOT.TB的檢測(cè)，外周血置于肝素鈉抗凝管中混勻后與RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液1∶1混勻，加在Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上層，離心分離出單個(gè)核細(xì)胞，后續(xù)操作步驟同胸腔積液T-SPOT.TB的檢測(cè)。陽(yáng)性結(jié)果判定[8]：檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)－陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)（0～5個(gè)）≥6為陽(yáng)性；檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)＞2×陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)（≥6個(gè)）為陽(yáng)性；實(shí)驗(yàn)結(jié)果中陽(yáng)性質(zhì)控均正常（陽(yáng)性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥20個(gè)）；不符合上述陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)且陽(yáng)性質(zhì)控正常時(shí)為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0軟件，偏態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（范圍）表示。 以頻數(shù)形式表示計(jì)量資料，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)性方法分析T-SPOT.TB及胸腔積液ADA相關(guān)生化指標(biāo)間的相關(guān)性，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合臨床，將單因素分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）的變量納入多因素logistic回歸模型，以建立預(yù)測(cè)模型。將多因素分析中P＜0.001的獨(dú)立危險(xiǎn)因素納入療效評(píng)估模型。將胸腔積液總蛋白＞30.91 g/L、胸腔積液ADA＞31.65 U/L、PPD試驗(yàn)陰性、TB-Ab檢測(cè)陰性、T-SPOT.TB陽(yáng)性、肝功能不全、結(jié)核接觸史的患者各予以賦1分，得分＞5為高風(fēng)險(xiǎn)組，＞2～5分為中風(fēng)險(xiǎn)組，≤2分為低風(fēng)險(xiǎn)組。最終分值越高，則風(fēng)險(xiǎn)越高[9]。受試者工作特征（ROC）曲線分析模型對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核患者的預(yù)測(cè)價(jià)值，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較

兩組患者一般臨床資料比較顯示：對(duì)比活動(dòng)性肺結(jié)核組和非結(jié)核組性別、年齡、BMI等基本資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明分組在后續(xù)的指標(biāo)中具有可比性。兩組患者球蛋白、肌酐、吸煙史、糖尿病史、總膽紅素、細(xì)菌感染、支氣管擴(kuò)張、哮喘、實(shí)體瘤和血管炎比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組患者結(jié)核接觸史、乙型肝炎、肝功能不全和結(jié)節(jié)性紅斑相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般臨床資料比較Table 1 Patient characteristics compared between patients with active tuberculosis and those without tuberculosis

2.2 兩組患者T-SPOT.TB和胸腔積液ADA相關(guān)生化指標(biāo)的比較

活動(dòng)性肺結(jié)核組胸腔積液總蛋白、胸腔積液ADA和胸腔積液LDH水平均高于非結(jié)核組，且兩組患者在TB-Ab檢測(cè)陰性、外周血T-SPOT.TB陽(yáng)性、胸腔積液T-SPOT.TB陽(yáng)性、胸腔積液總蛋白、胸腔積液ADA（P＜0.01），PPD試驗(yàn)陰性和胸腔積液LDH（P＜0.05）中比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 T-SPOT.TB和胸腔積液ADA相關(guān)生化指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between tuberculosis assays and relevant biomarkers and T-SPOT.TB test in pleural effusion

2.3 影響因素分析

根據(jù)本院201例患者的一般資料進(jìn)行多因素分析，將單因素分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入分析，發(fā)生活動(dòng)性肺結(jié)核為因變量，建立預(yù)測(cè)模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)胸腔積液總蛋白、胸腔積液ADA、PPD試驗(yàn)陰性、TB-Ab檢測(cè)陰性、外周血T-SPOT.TB陽(yáng)性、胸腔積液T-SPOT.TB陽(yáng)性、肝功能不全、結(jié)核接觸史為活動(dòng)性肺結(jié)核發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)圖1。

2.4 相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析顯示，PPD試驗(yàn)陰性、TB-Ab檢測(cè)陰性、外周血T-SPOT.TB陽(yáng)性分別與生化指標(biāo)胸腔積液總蛋白、胸腔積液ADA、胸腔積液T-SPOT.TB呈正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 診斷價(jià)值

ROC曲線分析表明：胸腔積液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB和胸腔積液ADA最佳臨界值分別為276.43×106/mL、39.68×106/mL和45.36 U/L，ROC曲線AUC分別為0.712、0.698和0.669，且靈敏度分別為75.31%、72.93%和67.12%，特異度分別為73.64%、71.62%和62.09%，具有診斷價(jià)值。胸腔積液T-SPOT.TB、ADA聯(lián)合預(yù)測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核病與外周血T-SPOT.TB、胸腔積液ADA聯(lián)合預(yù)測(cè)時(shí)AUC分別為0.826與0.811 （P＜0.001），靈敏度分別為83.49%與80.62%，特異度分別為70.36%與67.24%，均較三者單獨(dú)預(yù)測(cè)時(shí)明顯增加（P＜0.05），說(shuō)明聯(lián)合診斷價(jià)值更高。見(jiàn)圖2。

2.6 建立活動(dòng)性肺結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型

將獨(dú)立危險(xiǎn)因素納入構(gòu)建中高?；顒?dòng)性肺結(jié)核患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，得分＞5為高風(fēng)險(xiǎn)組，＞2～5分為中風(fēng)險(xiǎn)組，≤2分為低風(fēng)險(xiǎn)組。見(jiàn)圖3。

2.7 分析模型效能

療效評(píng)估模型的評(píng)價(jià)：ROC曲線顯示，曲線AUC=0.837，95%CI：0.751～0.897，診斷靈敏度和特異度分別為84.00%和69.37%，結(jié)果提示該評(píng)估模型對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核患者具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，見(jiàn)圖4。

3 討論

結(jié)核病是一種慢性傳染病，全世界每年估計(jì)有近180萬(wàn)與結(jié)核病相關(guān)患者死亡[10]。從全球結(jié)核病疫情控制情況來(lái)看，中國(guó)是主要的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家。我國(guó)活動(dòng)性肺結(jié)核患者每年死亡人數(shù)約5萬(wàn)，且近年發(fā)病率持續(xù)增高[11]。結(jié)核病可累及全身各個(gè)系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)多樣且不典型，在臨床上的診斷較為困難，誤診率較高。我國(guó)是結(jié)核病高發(fā)區(qū)，如何對(duì)患者進(jìn)行及早有效的診斷是目前臨床上亟待解決的問(wèn)題。痰培養(yǎng)、影像學(xué)檢查、PPD試驗(yàn)及臨床表現(xiàn)是當(dāng)前臨床上綜合判斷結(jié)核病的方法，但PPD試驗(yàn)及痰培養(yǎng)在常規(guī)接種卡介苗國(guó)家的診斷特異度和靈敏度較低[12]。影像學(xué)檢查和臨床表現(xiàn)是診斷結(jié)核病的輔助手段，但無(wú)法確診，因此尋找早期診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的快速、準(zhǔn)確方法至關(guān)重要。目前診斷方法較多，但每種診斷方法均有不一樣的特異度和靈敏度。T-SPOT.TB、PPD試驗(yàn)、胸腔積液ADA等均是臨床常用于檢測(cè)結(jié)核病的方法[13-15]。據(jù)此，本研究探討聯(lián)合T-SPOT.TB和胸腔積液ADA對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核患者的診斷價(jià)值，為臨床上早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及療效評(píng)估提供更客觀科學(xué)的依據(jù)。

T-SPOT.TB是近年來(lái)興起的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的新技術(shù)，對(duì)結(jié)核感染診斷具有較高的靈敏度和特異度。張群[16]研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB在不同人群中的靈敏度和特異度波動(dòng)較大，若將其作為診斷結(jié)核病的排除性標(biāo)準(zhǔn)，會(huì)導(dǎo)致T-SPOT.TB低敏感性人群的結(jié)核病漏診率大大增加；有研究表明活動(dòng)性肺結(jié)核患者胸腔積液ADA水平高于非結(jié)核患者，ADA的測(cè)定是目前性價(jià)比較高的診斷手段[17]，所以考慮兩者聯(lián)合提高患者診斷率。本研究回顧性分析患者臨床資料，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核組和非結(jié)核組性別、年齡、BMI、球蛋白、肌酐、吸煙史、糖尿病史、總膽紅素、細(xì)菌感染、支氣管擴(kuò)張、哮喘、實(shí)體瘤和血管炎等比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)核接觸史、乙型肝炎、肝功能不全和結(jié)節(jié)性紅斑的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PPD試驗(yàn)是臨床上診斷結(jié)核分枝桿菌的傳統(tǒng)措施，可檢測(cè)出卡介苗及環(huán)境中的分枝桿菌，是通過(guò)利用多種抗原混合物進(jìn)行檢測(cè)。TB-Ab檢測(cè)可反映出肺結(jié)核患者機(jī)體生化及體液免疫方面的改變[15]。胸腔積液是一種常見(jiàn)臨床癥狀，多由胸膜、肺、多種肺外疾病、感染所致，目前臨床上已開(kāi)展的檢測(cè)項(xiàng)目包括胸腔積液ADA、LDH、腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原和總蛋白等檢測(cè)，有助于結(jié)核病的鑒別和診斷[6]。 本研究中活動(dòng)性肺結(jié)核組患者胸腔積液總蛋白、ADA和LDH水平均高于非結(jié)核組，且活動(dòng)性肺結(jié)核TB-Ab檢測(cè)陰性、外周血T-SPOT.TB陽(yáng)性、胸腔積液T-SPOT.TB陽(yáng)性、PPD試驗(yàn)陰性患者比例均大于非結(jié)核組，與蔣鵬[6]、 景淑賢等[18]研究結(jié)果相一致。在此基礎(chǔ)上研究T-SPOT.TB與胸腔積液ADA相關(guān)生化指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)TB-Ab檢測(cè)陰性、PPD試驗(yàn)陰性、T-SPOT.TB陽(yáng)性分別與胸腔積液總蛋白、胸腔積液ADA、胸腔積液T-SPOT.TB呈正相關(guān)。ROC曲線分析驗(yàn)證了胸腔積液T-SPOT.TB聯(lián)合胸腔積液ADA、外周血T-SPOT.TB聯(lián)合胸腔積液ADA的AUC分別為0.826、0.811，均較胸腔積液T-SPOT.TB、ADA、外周血T-SPOT.TB單獨(dú)預(yù)測(cè)的AUC明顯增加，提示聯(lián)合具有更高的診斷價(jià)值。

諸多研究表明年齡、結(jié)核接觸史、吸煙史等是導(dǎo)致活動(dòng)性肺結(jié)核發(fā)生的危險(xiǎn)因素[19-20]。本研究將單因素分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胸腔積液總蛋白、胸腔積液ADA、PPD試驗(yàn)陰性、TB-Ab檢測(cè)陰性、外周血T-SPOT.TB陽(yáng)性、胸腔積液T-SPOT.TB陽(yáng)性、肝功能不全、結(jié)核接觸史為活動(dòng)性肺結(jié)核發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。近年來(lái)，用于預(yù)測(cè)肺結(jié)核療效的評(píng)分系統(tǒng)、灰色預(yù)測(cè)模型、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型等應(yīng)用逐漸廣泛[21]。 但在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中仍缺乏一個(gè)良好的療效評(píng)估模型，本研究結(jié)合logistic多因素分析的獨(dú)立危險(xiǎn)因素構(gòu)建療效評(píng)估模型，ROC曲線結(jié)果表明AUC=0.837，95%CI：0.751～0.897，診斷靈敏度為84.00%，特異度為69.37%，說(shuō)明該模型具有較好的效能和一致性的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，T-SPOT.TB聯(lián)合胸腔積液ADA對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核患者具有較好的診斷及鑒別診斷價(jià)值，構(gòu)建基于T-SPOT.TB聯(lián)合胸腔積液ADA與其他危險(xiǎn)因素的療效評(píng)估模型，可提高有效預(yù)測(cè)患者發(fā)生活動(dòng)性肺結(jié)核水平，協(xié)助臨床醫(yī)師對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核患者采取有效的治療決策。