賈博欽，蔣彥，宋歌，朱玉林，吳小華

(石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院，石家莊 050011)

胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)后整倍體凍融胚胎移植(FET)成功的關(guān)鍵因素之一是選擇恰當?shù)膬?nèi)膜準備方案。常用的內(nèi)膜準備方案有自然周期方案、人工周期方案，自然周期方案適用于月經(jīng)周期規(guī)律者，但需要患者連續(xù)監(jiān)測卵泡，且經(jīng)常由于卵泡發(fā)育異常而取消周期可能性較大[1]。人工周期方案具有給藥方便、復診次數(shù)少和周期取消率低等優(yōu)點，臨床應用較自然周期更加廣泛，包括單純激素替代方案及加用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)的降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代方案，加用GnRH-a預處理可實現(xiàn)垂體下調(diào)，更好地避免自發(fā)排卵和周期取消[2]。目前大量研究認為，降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代方案較單純激素替代方案能明顯改善子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征(PCOS)等人群的妊娠結(jié)局[3-4]。但這兩種人工周期內(nèi)膜準備方案在無明顯合并癥的普通人群中研究較少。有研究顯示，在普通人群中GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代內(nèi)膜準備方案較單純激素替代方案的凍融胚胎移植的妊娠結(jié)局沒有明顯差別[5-6]；但也有研究顯示，普通人群在解凍移植前應用GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代內(nèi)膜準備方案較單純激素替代方案獲得更高的臨床妊娠率[7-9]。目前關(guān)于PGT后解凍移植更適于采用哪種人工周期內(nèi)膜準備方案尚缺乏相關(guān)研究，而PGT助孕人群中無明顯合并癥的普通人群居多，故研究PGT助孕普通人群對指導PGT臨床更有意義。本研究回顧性分析本院應用PGT后行GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代方案及單純激素替代方案FET的臨床結(jié)局，探討GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代內(nèi)膜準備方法對整倍體單囊胚解凍移植妊娠結(jié)局的影響。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析2019年3月至2021年6月在本院生殖醫(yī)學中心PGT檢測后應用人工周期內(nèi)膜準備方案的解凍移植周期103例。納入標準：PGT后解凍移植采用兩種人工周期方案進行內(nèi)膜準備；夫婦需有合理、充分的PGT助孕臨床指征，且進行了充分的遺傳咨詢；以上持續(xù)妊娠患者的產(chǎn)前診斷結(jié)果符合PGT胚胎遺傳學診斷結(jié)果。排除標準：合并有子宮內(nèi)膜異位癥(Ⅲ-Ⅳ期)、PCOS、中重度輸卵管積水、子宮肌瘤(粘膜下)、嚴重的子宮畸形、宮腔粘連病史。

二、研究方法

1.胚胎培養(yǎng)及胚胎活檢：PGT周期常規(guī)采用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)受精，受精后16～18 h觀察原核，37℃三氣培養(yǎng)箱(5% CO2、5% O2和90% N2)中G系列序貫培養(yǎng)培養(yǎng)至囊胚活檢，每枚囊胚活檢3～7個細胞，進行MALBAC全基因組擴增，二代測序技術(shù)檢測[10]。優(yōu)質(zhì)囊胚為囊胚擴張程度≥3期且≥BB級[11]，將移植囊胚分為優(yōu)質(zhì)囊胚和非優(yōu)質(zhì)囊胚。囊胚活檢后單管玻璃化冷凍，待胚胎遺傳學分析完成后擇期對可移植胚胎進行復蘇移植，復蘇采用梯度置換后37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。

2.內(nèi)膜準備方法：將研究對象根據(jù)在內(nèi)膜準備過程中是否注射GnRH-a進行預處理分為兩組，GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代組(研究組)為53例，單純激素替代組(對照組)為50例。(1)研究組處理方法：月經(jīng)2～3 d時，彩超檢查子宮附件無異常，給予肌肉注射GnRH-a(貝依，上海麗珠)3.75 mg，28 d后復診進行激素替代?；颊呙咳湛诜焖岽贫?補佳樂，拜耳藥業(yè)，德國)6～8 mg，6～8 d后超聲檢測子宮內(nèi)膜厚度，適時調(diào)整用藥劑量；藥物應用14～16 d后行超聲檢查并對雌二醇(E2)及孕酮(P)水平進行檢測；超聲顯示子宮內(nèi)膜厚度≥0.8 cm[12]，則開始進行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，即每日口服地屈孕酮(達芙通，雅培，荷蘭)20 mg及肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)60 mg；囊胚解凍移植在轉(zhuǎn)化6 d后進行，移植后繼續(xù)以上用藥。(2)對照組處理方法：月經(jīng)2～5 d時，彩超檢查子宮附件無異常，開始激素替代，其內(nèi)膜準備、內(nèi)膜轉(zhuǎn)化及黃體支持藥物的用法用量同降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代組。臨床妊娠者于孕8周起逐步減藥，孕12周時停藥物支持，孕16～20周的持續(xù)妊娠者需在本院產(chǎn)前診斷中心行產(chǎn)前診斷。

3.妊娠判斷標準：我中心PGT解凍移植采用單囊胚移植，均為整倍體胚胎。移植后28～35 d彩超提示宮內(nèi)探及孕囊回聲定義為臨床妊娠。持續(xù)妊娠為孕16周及以上者通過超聲監(jiān)測提示宮內(nèi)活胎[13]。

4.觀察指標：患者基礎(chǔ)臨床資料，包括女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(bFSH)、竇卵泡數(shù)(AFC)、轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度、轉(zhuǎn)化日E2及P水平等；臨床結(jié)局包括臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率、優(yōu)質(zhì)囊胚移植率、優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率和非優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，持續(xù)妊娠率=持續(xù)妊娠周期數(shù)(包括已活產(chǎn)者)/移植周期數(shù)×100%，優(yōu)質(zhì)囊胚移植率=優(yōu)質(zhì)囊胚移植周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率=優(yōu)質(zhì)囊胚移植妊娠周期數(shù)/優(yōu)質(zhì)囊胚移植周期數(shù)×100%，非優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率=非優(yōu)質(zhì)囊胚移植妊娠周期數(shù)/非優(yōu)質(zhì)囊胚移植周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、一般情況比較

本研究共納入PGT后應用人工周期準備內(nèi)膜的103例患者、103個FET周期，其中GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代組(研究組)53例，單純激素替代組(對照組)50例。兩組患者的女方年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH、AFC、轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度、轉(zhuǎn)化日E2水平及P水平比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般情況比較(-±s)

二、兩組患者妊娠結(jié)局比較

兩組患者共獲得臨床妊娠65例，早期流產(chǎn)2例，目前共獲得43例健康新生兒，均無明顯出生缺陷發(fā)生，尚有20例妊娠中。研究組的臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率均顯著高于對照組(P<0.05)；兩組患者優(yōu)質(zhì)囊胚移植率比較無顯著性差異(P>0.05)；研究組的優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率顯著高于對照組(P<0.05)，研究組的非優(yōu)質(zhì)囊胚妊娠率雖高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者妊娠結(jié)局比較(%)

三、Logistic回歸分析臨床妊娠率的影響因素

校正了兩組患者一般臨床資料及是否優(yōu)胚移植的混雜因素后，研究組相對于對照組的臨床妊娠率校正OR值為 3.788，95%CI(1.522，9.431)，最終模型的 Hosmer-Lemeshow檢驗結(jié)果表明模型擬合較好，表明GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代內(nèi)膜準備方案較單純激素替代方案可以提高PGT后整倍體單囊胚解凍移植的臨床妊娠率(表3)。

表3 二元Logistic回歸分析臨床妊娠率的影響因素

校正了兩組患者一般臨床資料及是否優(yōu)胚移植的混雜因素后，研究組相對于對照組的持續(xù)妊娠率校正OR值為2.974，95%CI(1.232，7.180)。最終模型的Hosmer-Lemeshow 檢驗結(jié)果表明模型擬合較好，表明GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代內(nèi)膜準備方案較單純激素替代方案可以提高PGT后整倍體單囊胚解凍移植的持續(xù)妊娠率(表4)。

表4 Logistic回歸分析持續(xù)妊娠率的影響因素

討 論

由于獲得胚胎遺傳學檢測結(jié)果需要一定時間，PGT助孕患者胚胎需全胚冷凍，故解凍移植成為PGT助孕的關(guān)鍵步驟。隨著PGT技術(shù)的發(fā)展應用，經(jīng)PGT技術(shù)篩選的整倍體胚胎可排除胚胎異常因素對妊娠結(jié)局造成的影響，在這一前提下，本研究中PGT后解凍移植前兩種內(nèi)膜準備方法比較得出的結(jié)果更準確。同時研究結(jié)果也可對經(jīng)過層層篩選，獲得珍貴胚胎的PGT助孕人群選擇解凍移植內(nèi)膜準備方案起到一定的指導作用。

本研究回顧了本院生殖中心近2年P(guān)GT應用人工周期內(nèi)膜準備的103例解凍移植周期，研究對象為無子宮內(nèi)膜異位癥(Ⅲ-Ⅳ期)、PCOS、中重度輸卵管積水、粘膜下子宮肌瘤等合并癥的人群，將研究對象內(nèi)膜準備根據(jù)是否進行GnRH-a預處理分為GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代方案組和單純激素替代方案組；將兩組患者的一般情況及妊娠結(jié)局進行了組間比較，結(jié)果表明GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代組臨床妊娠率及持續(xù)妊娠率均顯著高于單純激素替代組，且在兩組優(yōu)質(zhì)囊胚移植率無顯著差異情況下，GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代組不論優(yōu)質(zhì)還是非優(yōu)質(zhì)囊胚其臨床妊娠率均高于單純激素替代組，且前者有統(tǒng)計學意義；二元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，在校正了女方年齡、BMI等一般情況及是否優(yōu)胚移植的差異因素后，GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代組相比于單純激素替代組的臨床妊娠率校正OR值為3.788，95%CI(1.522，9.431)，持續(xù)妊娠率校正OR值為2.974，95%CI(1.232，7.180)。表明在整倍體囊胚移植時，排除其他因素后，GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代較單純替代周期進行內(nèi)膜準備可獲得更高的臨床妊娠率及持續(xù)妊娠率。相似的，國外一項研究表明，與單純激素替代周期(n=100)相比，GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代周期(n=110)具有更高的種植率和妊娠率[7]。Kang等[8]在排除了PCOS和子宮內(nèi)膜異位癥(Ⅳ期)的人群中對單純激素替代周期FET(n=88)與GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代周期FET(n=181)的臨床結(jié)局進行比較，結(jié)果表明，妊娠率在GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代周期中較高，但活產(chǎn)率無顯著差異。國內(nèi)一項對非子宮內(nèi)膜異位癥人群中解凍移植研究中，對GnRH-a降調(diào)節(jié)后激素替代內(nèi)膜準備組(試驗組)807個周期及單純激素替代內(nèi)膜準備組(對照組)2 755個周期進行妊娠結(jié)局比較，揭示在校正了混雜因素的多因素后也驗證了前者較后者能獲得更高的臨床妊娠率與活產(chǎn)率[9]，但以上研究均未排除胚胎異常因素對妊娠結(jié)局的影響。

GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代方案較單純激素替代方案能夠獲得更高的臨床妊娠率，考慮可能的相關(guān)因素如下：(1)單純激素替代方案子宮內(nèi)膜可在外源性雌激素的作用下有效生長，之后在外源性孕酮的作用下子宮內(nèi)膜種植窗的開放得以啟動，從而有效把握胚胎移植的時機，但外源的E2仍可直接或間接作用于下丘腦GnRH 神經(jīng)元，增加 GnRH 釋放脈沖的幅度，促使 GnRH 受體增多和垂體對其敏感性增強，可能會引起早發(fā)性的LH峰，從而影響子宮內(nèi)膜的微環(huán)境，干擾胚胎著床[14]。長效GnRH-a的作用原理是持續(xù)應用后垂體的GnRH受體被耗盡，降低了垂體分泌促性腺激素，從而導致卵巢無卵泡周期性發(fā)育，有效抑制內(nèi)源性LH峰，彌補單純激素替代方案無法保證完全垂體抑制的缺陷，同時GnRH-a可提高內(nèi)膜對外源性E2敏感性，改善子宮內(nèi)膜分型[15]。(2)長效GnRH-a的應用可以減少內(nèi)源性雌激素的釋放，血清雌激素水平的降低可能會改變后期子宮內(nèi)膜上種植窗的形成，亦有利于胚胎早期種植[16-17]；同時GnRH-a抑制HPO軸，降低卵泡期孕酮水平，防止種植窗提前開放，提高子宮內(nèi)膜容受性，從而改善妊娠結(jié)局[18]。(3)研究發(fā)現(xiàn)，GnRH 受體不僅存在于垂體，同時也存在于子宮內(nèi)膜組織[19]。有動物實驗表明，圍種植期間的胚胎發(fā)育與GnRH-a 的增加呈正相關(guān)性，圍種植期的胚胎表面存在GnRH-a受體，提示GnRH-a的長時間作用對子宮內(nèi)膜容受性和胚胎發(fā)育都有獲益[20]。研究推測，GnRH-a預處理后GnRHa 可能通過結(jié)合于胚胎及子宮內(nèi)膜上的GnRH受體，抑制胚胎毒性自身抗體的產(chǎn)生、增加子宮內(nèi)膜細胞黏附分子整合素avβ3的表達，從而改善內(nèi)膜容受性[21]。這與國內(nèi)的一項研究結(jié)論一致，后者還提出長效GnRH-a還可以提高種植窗期子宮內(nèi)膜表面的白血病抑制因子、血管內(nèi)皮生長因子、胞飲突的表達，降低腹腔中白細胞介素-1、腫瘤壞死因子等胚胎毒性因子的濃度，明顯改善盆腔及子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境，利于胚胎著床，提高臨床妊娠率[22]。

綜上所述，在應用GnRH-a進行降調(diào)節(jié)后，子宮內(nèi)膜的容受性可能通過以上途徑得到改善，從而更有利于胚胎著床。且目前從本研究統(tǒng)計差異結(jié)果來看，經(jīng)PGT篩選的整倍體單囊胚進行解凍移植時，GnRH-a降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代內(nèi)膜準備方案可能優(yōu)于單純激素替代方案。但近兩年受新冠肺炎疫情影響，我中心經(jīng)PGT檢測后凍融胚胎移植周期尚少，故需繼續(xù)累積周期數(shù)，同時需大樣本量進行前瞻性的研究，并對以上標記物進行檢測，以期得出更為有意義、更具統(tǒng)計說服力的結(jié)果來更好的指導臨床。