趙偉娥，陳攀宇，李玉潔，賈磊，梁曉燕

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，廣州 510000)

自然流產(chǎn)占妊娠總數(shù)的10%～15%，與胚胎、母體、父親以及環(huán)境等因素有關(guān)，胚胎非整倍體是導(dǎo)致流產(chǎn)最常見原因，占50%～60%[1]。因此，檢測(cè)流產(chǎn)組織的染色體對(duì)后續(xù)妊娠具有重要指導(dǎo)意義。輔助生殖(ART)治療中，常采用控制性促排卵(COH) 增加卵母細(xì)胞數(shù)目，使患者有剩余胚胎進(jìn)行優(yōu)選并冷凍，為患者提供盡可能多的移植機(jī)會(huì)。對(duì)發(fā)生過自然流產(chǎn)，尤其是因胚胎非整倍體導(dǎo)致流產(chǎn)的夫婦而言，移植同一取卵周期的胚胎，自然流產(chǎn)或胚胎染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加，從而陷入是否丟棄這些胚胎或行胚胎植入前非整倍體檢測(cè)(PGT-A)的困惑。目前，關(guān)于一次胚胎非整倍體導(dǎo)致流產(chǎn)是否影響同一取卵周期來源胚胎的妊娠結(jié)局，尚無相關(guān)研究。本研究對(duì)流產(chǎn)組織染色體結(jié)果為整倍體或非整倍體時(shí)移植同一取卵周期來源胚胎后的臨床結(jié)局進(jìn)行分析，觀察流產(chǎn)組織染色體整倍性對(duì)凍融胚胎移植(FET)的妊娠結(jié)局的影響，以期為同一取卵周期的冷凍胚胎再次移植提供指導(dǎo)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2012年3月至2020年1月在本中心行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者的臨床資料，對(duì)其稽留流產(chǎn)所行的清宮術(shù)中留取的流產(chǎn)組織行染色體核型分析，收集同一取卵周期有冷凍胚胎并行FET的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)既往有自然流產(chǎn)史；(2)反復(fù)種植失敗；(3)雙方或一方有染色體異常；(4)生殖道畸形等。

二、研究方法

1.促排卵與胚胎培養(yǎng)：根據(jù)患者年齡、卵巢儲(chǔ)備、既往對(duì)促排卵藥物的反應(yīng)性等，個(gè)體化選擇長方案或者拮抗劑方案。根據(jù)男方精液情況，行常規(guī)IVF或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)，18～20 h后觀察受精情況，出現(xiàn)兩個(gè)原核為正常受精。72 h后觀察胚胎并評(píng)分，對(duì)于符合囊胚培養(yǎng)條件的胚胎，轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)[2]，在第5天觀察胚胎質(zhì)量并評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Gardner評(píng)分系統(tǒng)[3]。

2.胚胎冷凍與復(fù)蘇：胚胎冷凍采用玻璃化冷凍方法[2]。冷凍時(shí)使用三種平衡溶液：A液為含12 mg/ml人血清白蛋白的4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES，Quinn’s，美國)平衡溶液，B液為A液+7.5%乙二醇+7.5%二甲亞砜，C液為A液+15%乙二醇+15%二甲亞砜。將胚胎依次放入A液2 min、B液2 min以及C液1 min后，30 s內(nèi)將胚胎轉(zhuǎn)移至冷凍載體，保存在液氮中。胚胎復(fù)蘇時(shí)，將胚胎從液氮中取出，在含0.33 mol/L蔗糖+10%血清蛋白替代物的HEPES溶液中平衡2 min，然后轉(zhuǎn)移至含0.2 mol/L蔗糖+10%血清蛋白替代物的HEPES溶液中平衡3 min，再轉(zhuǎn)移至含10% 血清蛋白替代物的HEPES溶液中平衡5 min后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

3.凍融周期的內(nèi)膜準(zhǔn)備：自然周期(NC)：既往排卵規(guī)律的患者，定期經(jīng)陰道B超及血雌激素(E2)水平監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況以及內(nèi)膜厚度，確定排卵時(shí)間，排卵后若內(nèi)膜≥7 mm，第3天移植卵裂期胚胎或第5天移植囊胚期胚胎。替代周期(HRT)：既往無規(guī)律排卵的患者，月經(jīng)第2～3天使用戊酸雌二醇(拜耳制藥，德國)，根據(jù)內(nèi)膜生長情況與E2水平調(diào)整用藥，當(dāng)內(nèi)膜厚度≥7 mm且用藥時(shí)間不少于10 d時(shí)，給予陰道用黃體酮(Besins，比利時(shí))轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，第3天移植卵裂期胚胎，第5天移植囊胚期胚胎。

4.流產(chǎn)組織收集、培養(yǎng)與染色體核型分析：稽留流產(chǎn)患者常規(guī)行清宮術(shù)，術(shù)中在無菌條件下將絨毛組織與蛻膜、血塊等分離，留取絨毛組織并置入含有抗生素的培養(yǎng)液中送入實(shí)驗(yàn)室行絨毛細(xì)胞培養(yǎng)。每個(gè)標(biāo)本采取雙線培養(yǎng)，將絨毛組織用膠原酶II和胰酶消化后置入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)絨毛細(xì)胞生長到適宜密度后回收細(xì)胞固定，制備染色體核型分析玻片，將玻片放入胰酶溶液中靜置20～30 s，甩干后放入吉姆薩染液中染色4～5 min，蒸餾水中漂洗一次晾干。染色體結(jié)果判讀參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名國際體制[4]。每例染色體標(biāo)本計(jì)數(shù)分析20個(gè)以上核型，如果檢出核型異常，則分析50個(gè)核型，存在嵌合體則分析100個(gè)核型。

5.妊娠結(jié)局及觀察指標(biāo)：臨床妊娠定義為陰道B超證實(shí)的胚胎位于子宮內(nèi)且有胎心者；早期流產(chǎn)定義為12周之前的胚胎丟失；不論孕周大小，至少獲得一個(gè)存活嬰兒定義為活產(chǎn)。觀察指標(biāo)如下：臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%、早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%、活產(chǎn)率=活產(chǎn)數(shù)/移植周期數(shù)×100%、累積活產(chǎn)率=所有活產(chǎn)數(shù)/患者例數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般臨床資料

本研究共納入380例患者、539個(gè)周期。根據(jù)流產(chǎn)組織染色體結(jié)果將其分為兩組：整倍體組(206例患者、292個(gè)周期)與非整倍體組(174例患者、247個(gè)周期)。整倍體組取卵時(shí)年齡顯著小于非整倍體組(P<0.05)，AMH值顯著高于非整倍體組AMH(P<0.05)，原發(fā)不孕占比顯著高于非整倍體組(P=0.02)。兩組患者BMI與流產(chǎn)孕周比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 整倍體組與非整倍體組臨床資料[(-±s)，%]

二、兩組患者同一取卵周期冷凍胚胎移植情況比較

兩組患者內(nèi)膜轉(zhuǎn)換日的內(nèi)膜厚度與E2水平、平均移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、平均移植周期數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，囊胚移植占比在兩組中無顯著差異(P>0.05)。整倍體組中，替代周期占比更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)(表2)。

表2 兩組患者同一取卵周期冷凍胚胎移植情況比較[(-±s)，%]

三、兩組患者同一取卵周期FET的妊娠結(jié)局

兩組患者的臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及累積活產(chǎn)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者同一取卵周期FET的妊娠結(jié)局比較(%)

四、兩組患者臨床結(jié)局的GEE分析

流產(chǎn)組織染色體結(jié)果與臨床妊娠率及活產(chǎn)率無相關(guān)性(P-adj>0.05)，取卵時(shí)年齡、移植胚胎數(shù)目是影響臨床妊娠率及活產(chǎn)率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P-adj<0.05)(表4)。

表4 整倍體組與非整倍體組臨床結(jié)局的GEE分析

討 論

本研究分析了流產(chǎn)組織染色體整倍性對(duì)移植同一取卵周期冷凍胚胎的妊娠結(jié)局的影響，比較整倍體組與非整倍體組的臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及累積活產(chǎn)率。結(jié)果表明，兩組患者的妊娠結(jié)局無顯著差異，在排除取卵時(shí)年齡、移植胚胎數(shù)目等混雜因素后，整倍體組與非整倍體組的臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及累積活產(chǎn)率均無顯著差異。

自然流產(chǎn)給女性帶來巨大的心理創(chuàng)傷，其中創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)、焦慮和抑郁可持續(xù)數(shù)月，并且患者會(huì)陷入對(duì)再次流產(chǎn)的擔(dān)憂與恐懼中[5]。既往研究顯示，流產(chǎn)可增加再次流產(chǎn)及染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)；羊水穿刺結(jié)果表明，既往無流產(chǎn)史，染色體異常率為1.39%，若有一次流產(chǎn)史，染色體異常率為1.67%；當(dāng)發(fā)生三次流產(chǎn)后，這一數(shù)值上升到2.18%[6]。但有研究提出不同意見，即流產(chǎn)組織染色體結(jié)果與既往流產(chǎn)次數(shù)無關(guān)[7-8]；年齡是影響胚胎染色體整倍性的主要因素，既往流產(chǎn)次數(shù)、活產(chǎn)次數(shù)均不影響整倍體胚胎比例[9-10]。

胚胎非整倍體是流產(chǎn)的主要原因，占50%～60%[1]。目前，關(guān)于流產(chǎn)組織染色體非整倍性對(duì)后續(xù)妊娠結(jié)局影響的研究甚少，小樣本研究結(jié)果提示，第一次流產(chǎn)組織非整倍體與再次流產(chǎn)組織的染色體無關(guān)，整倍體組與非整倍體組的妊娠結(jié)局無顯著差異[11-13]。迄今，針對(duì)非整倍體導(dǎo)致流產(chǎn)是否影響同一取卵周期冷凍胚胎的臨床結(jié)局，暫無相關(guān)報(bào)道。

COH通過使用外源性促性腺激素(Gn)，以期獲得適當(dāng)數(shù)量的卵母細(xì)胞，將胚胎冷凍保存用于后續(xù)移植，從而提高累積活產(chǎn)率、改善臨床結(jié)局。COH的原理是刺激原本因Gn不足而閉鎖的同一發(fā)育階段卵泡繼續(xù)發(fā)育。理論上，同一批次卵母細(xì)胞發(fā)育軌跡與發(fā)育背景類似，它們的命運(yùn)在一定程度上具有相似性。既往研究提示，卵母細(xì)胞發(fā)育異?；蛲嘶荒茴A(yù)測(cè)同一批次卵母細(xì)胞的妊娠結(jié)局[14-15]，新鮮胚胎移植的結(jié)果并不影響姐妹胚胎在凍融周期的臨床結(jié)局[16]。本研究結(jié)果也提示，流產(chǎn)組織的染色體整倍性不影響凍融周期的妊娠結(jié)局，年齡與胚胎移植數(shù)目是影響妊娠結(jié)局的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，我們推論：同一取卵周期來源胚胎，各自發(fā)育潛能不同，是相互獨(dú)立的事件，妊娠結(jié)局主要受年齡及移植胚胎數(shù)目影響。

目前，PGT-A已廣泛應(yīng)用于ART的相關(guān)治療。僅發(fā)生過一次染色體異常所致流產(chǎn)的患者，能否從PGT-A中獲益，目前相關(guān)研究甚少。Zhou等[17]研究的結(jié)果表明，既往有一次染色體非整倍體異常導(dǎo)致流產(chǎn)史的患者中，PGT-A組與非PGT-A組的早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及累積活產(chǎn)率均無顯著差異，對(duì)這些患者行PGT-A臨床意義不大。本研究結(jié)果也支持這一結(jié)論，在我們研究中，流產(chǎn)組織非整倍性并不影響姐妹胚胎的妊娠結(jié)局。

作為回顧性研究，本項(xiàng)工作難以避免一些局限性，例如本項(xiàng)工作中非整倍體組取卵時(shí)年齡顯著高于整倍體組年齡，不同患者移植次數(shù)不一樣導(dǎo)致出現(xiàn)重復(fù)數(shù)據(jù)引起的偏倚等。故此，我們采取了措施來改善研究的可信性：控制納入患者的基礎(chǔ)條件，如排除復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及反復(fù)種植失敗患者，排除雙方或一方染色體異?；颊叩?；采用GEE糾正了重復(fù)數(shù)據(jù)所致偏倚及年齡、移植胚胎數(shù)目等混雜因素的影響；計(jì)算累積活產(chǎn)率，最大限度的反映了同一取卵周期的所有胚胎情況；本研究所有數(shù)據(jù)來自于同一中心，尤其是染色體結(jié)果判讀，有專門的人員負(fù)責(zé)，減少了操作人員和技術(shù)操作相關(guān)的偏差；本項(xiàng)工作共納入539個(gè)周期，樣本量大，可以反映其實(shí)際狀況。因此，本研究結(jié)果具有可信度，有助于對(duì)臨床治療方案提供參考資料，給患者咨詢提供指導(dǎo)意義。

綜上所述，非整倍體組與整倍體組比較，兩組的臨床妊娠結(jié)局無顯著差異，一次染色體非整倍體導(dǎo)致流產(chǎn)后，移植同一取卵周期的冷凍胚胎是安全有效的。由于本研究為單中心研究，后續(xù)還需要更多研究來證實(shí)丟棄這些姐妹胚胎或?qū)ζ湫蠵GT-A的實(shí)際臨床意義。