張琦，劉倩，漆倩榮，謝青貞

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)的妊娠率與卵巢儲(chǔ)備功能、胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜容受性及黃體功能等諸多因素密切相關(guān)[1]。既往研究表明，扳機(jī)日過高的雌二醇(E2)水平可降低鮮胚移植周期臨床妊娠率[2]，但取卵后E2水平的變化是否影響鮮胚移植患者妊娠結(jié)局目前仍存在爭議。Sharara[3]研究結(jié)果顯示，取卵后黃體中期E2較扳機(jī)日E2急劇下降(扳機(jī)日E2/胚胎移植后第3天E2>5)時(shí)鮮胚移植臨床妊娠率顯著降低。Rehman等[4]將胚胎移植日E2按40/60/80分位數(shù)分組，發(fā)現(xiàn)隨著胚胎移植日E2高于40、60、80個(gè)百分位數(shù)，臨床妊娠率也逐漸升高。Friedler等[5]及Hung等[6]的研究結(jié)果則顯示，黃體中期較扳機(jī)日E2急劇下降與鮮胚移植臨床妊娠結(jié)局無關(guān)。本研究擬比較拮抗劑方案和卵泡期長方案促排卵患者行D3鮮胚移植后第3天E2較扳機(jī)日E2下降情況，探討黃體中期E2下降水平對鮮胚移植妊娠結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2020年10月至2021年10月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI-ET助孕的患者臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)采用拮抗劑方案或卵泡期長方案促排卵，且行D3新鮮胚胎移植；(2)抗苗勒管激素(AMH)≥1.1 ng/ml；(3)基礎(chǔ)卵泡刺激素(bFSH)≤12 U/L，獲卵數(shù)≥5；(4)女方年齡<42歲；(5)陰道分泌物檢查及血液TORCH檢查正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)自身免疫因素異常；(2)宮腔粘連或子宮畸形等明確影響胚胎著床的患者；(3)合并甲狀腺和糖尿病等內(nèi)分泌疾病的患者；(4)雙方染色體核型異常；(5)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。

本研究共納入患者212例。根據(jù)促排卵方案不同，分為拮抗劑組99例(包括妊娠組47例和未妊娠組52例)、卵泡期長方案組113例(包括妊娠組67例和未妊娠組46例)。因在該期間本中心行黃體期長方案僅12例，而拮抗劑方案行囊胚移植的周期數(shù)少，故未納入該類患者。

二、促排卵治療

1.拮抗劑方案：患者于月經(jīng)來潮第2天開始每天注射重組人卵泡刺激素(r-FSH，果納芬，默克，瑞士)或尿促性腺激素(HMG，麗申寶，珠海麗珠)112.5～225 U，定期B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況和生殖激素水平以判斷卵巢反應(yīng)性，根據(jù)卵巢反應(yīng)性調(diào)整用藥劑量。當(dāng)卵泡直徑達(dá)14 mm時(shí)每天加用拮抗劑藥物(GnRH-ant，思則凱，默克，瑞士)0.25 mg，連續(xù)應(yīng)用至絨毛膜促性腺激素(HCG)日[7]。

2.卵泡期長方案：患者于月經(jīng)來潮第2天肌肉注射長效GnRH-a(達(dá)菲林，益普生，法國)3.75 mg，末次注射28～30 d后行超聲和生殖激素檢測是否達(dá)降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)。完全降調(diào)后(FSH<5 U/L，LH<5 U/L，E2<50 pmol/L，子宮內(nèi)膜厚度<5 mm，卵泡直徑<5 mm)開始進(jìn)行促排卵，每天肌肉注射r-FSH或HMG，行陰道超聲監(jiān)測和生殖激素水平測定，根據(jù)卵巢反應(yīng)性調(diào)整用藥劑量[7]。

三、取卵、胚胎培養(yǎng)及胚胎移植

當(dāng)有3個(gè)以上卵泡直徑≥17 mm或兩個(gè)卵泡直徑≥18 mm時(shí)停用促性腺激素(Gn)，并于當(dāng)晚注射人源HCG(珠海麗珠)8 000～10 000 U，36 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。取卵后行常規(guī)IVF或ICSI，胚胎培養(yǎng)3 d評級(jí)后選擇1～2個(gè)胚胎移植，剩余胚胎采用玻璃化冷凍法行冷凍[7]。

四、黃體支持及妊娠診斷

胚胎移植后常規(guī)給予黃體酮注射液(浙江仙琚)40 mg肌肉注射及地屈孕酮片(達(dá)芙通，雅培，荷蘭)30 mg口服進(jìn)行黃體支持。于鮮胚移植后第12天查血HCG，HCG>10 U/L提示妊娠；胚胎移植后30 d行陰道超聲檢查，見孕囊者確定為臨床妊娠(包括宮內(nèi)或?qū)m外妊娠)。

五、觀察指標(biāo)

1.基本資料：包括年齡、不孕類型、不孕年限、不孕原因、血清bFSH水平、血清AMH水平以及受精方式。

2.促排卵情況：Gn用量、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN受精數(shù)、2PN卵裂數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、扳機(jī)日孕酮(P)水平。

3.扳機(jī)日和黃體中期血清E2水平：E2下降幅度=(1-移植后第3天E2/扳機(jī)日E2)×100%。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩種促排卵方案中妊娠組與未妊娠組患者的基本資料

本研究共納入212例IVF/ICSI患者，其中妊娠組114例，未妊娠組98例，總體的臨床妊娠率為53.8%。拮抗劑方案和卵泡期長方案中的妊娠組與未妊娠組患者間的年齡、不孕類型、不孕原因、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、受精方式等基本資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩種促排卵方案中妊娠組與未妊娠組患者的基本資料比較[(-±s)，n(%)]

續(xù)表

二、兩種促排卵方案中妊娠組與未妊娠組患者的促排卵結(jié)果

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，拮抗劑方案和卵泡期長方案中的妊娠組與未妊娠組患者間Gn用量、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN受精數(shù)、2PN卵裂數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)；拮抗劑方案中妊娠組扳機(jī)日P水平顯著低于未妊娠組(P<0.05)，而卵泡期長方案中妊娠組與未妊娠組的扳機(jī)日P水平無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩種促排卵方案中妊娠組與未妊娠組患者的促排卵情況比較[(-±s)]

三、不同促排卵方案患者的血清E2水平及下降幅度比較

拮抗劑方案組患者扳機(jī)日血清E2水平顯著高于卵泡期長方案組(P<0.05)，但兩組患者移植后第3天的E2水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；下降幅度比較上，拮抗劑方案組E2下降幅度顯著高于卵泡期長方案組(P<0.05)，而臨床妊娠率(47.5%)顯著低于卵泡期長方案組(59.3%)(P<0.05)(表3)。

表3 兩種促排方案E2下降幅度比較[(-±s)，%]

四、兩種促排卵方案中妊娠組與未妊娠組患者血清E2水平及下降幅度比較

為了分析血清E2水平及下降幅度對妊娠結(jié)局的影響，分別比較了兩種促排卵方案中妊娠組與未妊娠組扳機(jī)日及移植后第3天E2的血清水平。拮抗劑方案組中，妊娠組與未妊娠組患者在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清E2水平均無顯著性差異(P>0.05)，但未妊娠組E2下降幅度顯著高于妊娠組(P<0.05)；而在卵泡期長方案周期中，妊娠組與未妊娠組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清E2水平及E2下降幅度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表4)。

表4 不同促排方案中妊娠與未妊娠組患者E2下降幅度比較[(-±s)]

五、Logistic回歸分析E2下降幅度對妊娠結(jié)局的影響

前面結(jié)果顯示，拮抗劑方案中妊娠組和未妊娠組患者的E2下降幅度有顯著性差異，因此，根據(jù)本方案E2下降幅度的四分位數(shù)(35.42/62.61/82.38)分為E2下降幅度<35.42%、35.43%～62.60%、62.61%～82.37%、>82.38%四組。單因素Logistic回歸分析結(jié)果表明，與E2下降幅度<35.42%組相比，E2下降幅度>82.38%與臨床妊娠結(jié)局顯著相關(guān)(P=0.021，OR=0.233)。為進(jìn)一步排除其他混雜因素的影響，確定E2下降幅度與妊娠結(jié)局的相關(guān)性，以是否臨床妊娠為因變量，將可能影響拮抗劑方案周期妊娠結(jié)局的因素包括E2下降幅度、年齡、不孕年限、不孕原因、AMH、基礎(chǔ)FSH水平、獲卵數(shù)及扳機(jī)日P值納入自變量行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果表明調(diào)整混雜因素后，與E2下降幅度<35.42%組相比，>82.38%組仍與妊娠結(jié)局顯著相關(guān)(P=0.020，OR=0.117)，即在拮抗劑方案周期中，E2下降幅度大于82.38%是影響臨床妊娠的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表5)。

表5 Logistic回歸分析拮抗劑方案E2下降幅度對妊娠結(jié)局的影響

通過計(jì)算ROC曲線下面積(AUC)來評估拮抗劑方案周期中E2下降幅度大于82.38%對臨床妊娠結(jié)局的預(yù)測價(jià)值，結(jié)果顯示拮抗劑方案移植D3胚胎周期中E2下降幅度大于82.38%對臨床妊娠結(jié)局有良好的預(yù)測價(jià)值[AUC=0.799，95%CI(0.702，0.896)](圖1)。

圖1 拮抗劑方案周期E2下降幅度預(yù)測臨床妊娠結(jié)局的ROC曲線

討 論

在輔助生殖(ART)助孕周期中，卵丘復(fù)合物的取出會(huì)伴隨著E2水平迅速下降，到黃體中期卵巢顆粒黃體細(xì)胞及卵泡膜黃體細(xì)胞繼續(xù)分泌E2和P，參與胚胎著床和妊娠的建立，此時(shí)期的E2和P水平可反映黃體功能。Stewart等[8]首次報(bào)道在供精人工授精周期中，妊娠組黃體期E2顯著高于未妊娠組，提示黃體期E2水平可能是影響妊娠結(jié)局的關(guān)鍵因素。Ganesh等[9]發(fā)現(xiàn)，在黃體期長方案鮮胚移植周期中，妊娠組與未妊娠組移植當(dāng)天E2水平無顯著差異，而在移植后第7天和第14天，妊娠組的E2水平顯著高于未妊娠組。而Friedler等[5]及Narvekar等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鮮胚移植后黃體中期E2下降幅度與妊娠結(jié)局無明顯相關(guān)性。鑒于以上研究多關(guān)注GnRH-a降調(diào)節(jié)周期，對使用拮抗劑方案關(guān)注較少，因此本研究將拮抗劑方案納入觀察對象，觀察不同促排方案中黃體中期E2下降幅度是否對妊娠結(jié)局存在影響。

黃體期E2對子宮內(nèi)膜容受性、胚胎植入和妊娠維持有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，黃體期E2促進(jìn)分泌期子宮內(nèi)膜孕激素受體(PR)增加，維持必要的PR濃度，從而介導(dǎo)和完成P的子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化功能[11]。Choi等[12]在缺乏類固醇激素的切除卵巢小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)黃體中期E2缺乏時(shí)可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的自噬增加，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降，影響胚胎植入，而且與扳機(jī)日E2高水平影響子宮內(nèi)膜容受性不同，黃體中期E2水平下降會(huì)下調(diào)子宮內(nèi)膜中某些因子(例如白介素-1，腫瘤壞死因子-α、干擾素)的表達(dá)，改變子宮內(nèi)膜局部分子微環(huán)境[10]，干擾胚胎植入，以上結(jié)果提示黃體中期E2下降可能與ART妊娠結(jié)局相關(guān)。

卵泡期長方案操作簡單且有較好的經(jīng)濟(jì)適用性，相較于其他方案對子宮內(nèi)膜厚度和胚胎種植率等有一定改善，已成為很多生殖中心的主要促排方案。拮抗劑方案相較于卵泡期長方案，具有靈活個(gè)體化的特點(diǎn)，對PCOS、高反應(yīng)及低反應(yīng)患者均有良好的應(yīng)用前景，但鮮胚移植妊娠率低，黃體功能穩(wěn)定性欠佳。有研究發(fā)現(xiàn)，在使用拮抗劑方案超促排卵時(shí)，血清E2的水平可能隨著血清P水平升高而減少，并且與GnRH-a激動(dòng)劑方案相比，這種降低程度更大[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)，相較于卵泡期長方案，拮抗劑方案無論是妊娠組還是未妊娠組，E2下降幅度均更大，提示拮抗劑方案黃體功能穩(wěn)定性欠佳。因此有人提出在拮抗劑方案黃體支持時(shí)額外補(bǔ)充E2可能對妊娠結(jié)局有所幫助。但是，目前對于拮抗劑方案該不該加強(qiáng)雌激素的補(bǔ)充，以及補(bǔ)充的條件和方式仍存在較大爭議。一項(xiàng)前瞻性研究也發(fā)現(xiàn)，在使用拮抗劑方案周期中黃體支持時(shí)額外補(bǔ)充E2能顯著提高胚胎植入率，降低黃體期陰道出血發(fā)生率[14]。然而一項(xiàng)系統(tǒng)薈萃分析顯示，在拮抗劑方案中黃體期額外補(bǔ)充E2并不能改善妊娠結(jié)局[15]。同時(shí)另外兩項(xiàng)研究表明，在拮抗劑方案周期中利用不同的E2途徑(包括口服、透皮貼劑或透皮凝膠)來支持黃體期并沒有提高妊娠率[16-17]。

本研究同時(shí)納入了卵泡期長方案和拮抗劑方案進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵泡期長方案E2下降幅度與妊娠結(jié)局無關(guān)，其可能與卵泡期長方案相較于拮抗劑方案E2下降幅度小，黃體功能更加穩(wěn)定，足以支持胚胎植入并維持妊娠有關(guān)。本研究通過Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)拮抗劑方案中E2下降幅度與妊娠結(jié)局相關(guān)，且當(dāng)E2下降幅度>82.38%時(shí)，臨床妊娠率顯著下降；ROC曲線分析進(jìn)一步證實(shí)，在拮抗劑方案中E2下降幅度>82.38%對妊娠結(jié)局有良好的預(yù)測價(jià)值(AUC=0.799)，提示在拮抗劑方案移植D3胚胎周期中，當(dāng)E2下降幅度>82.38%時(shí)有必要額外補(bǔ)充E2加強(qiáng)黃體支持，但給藥劑量及給藥途經(jīng)仍有待研究。本結(jié)果可作為臨床工作中對拮抗劑方案促排卵患者行雌激素補(bǔ)充治療的重要參考。

本研究的局限性在于：(1)納入研究例數(shù)有限，可能影響結(jié)果的可靠性，未來仍需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析證實(shí)；(2)未進(jìn)一步納入比較黃體期長方案及D5囊胚移植后E2下降趨勢與臨床妊娠率關(guān)系；(3)本研究為回顧性隊(duì)列分析，可能存在一定程度的用藥偏倚和混雜因素，未來需要進(jìn)一步行前瞻性研究來證實(shí)。

綜上所述，拮抗劑方案D3胚胎移植周期中，E2下降幅度與妊娠結(jié)局相關(guān)，且當(dāng)下降幅度大于82.38%時(shí)其臨床妊娠率顯著降低；而卵泡期長方案中D3胚胎移植后第3天E2下降水平不影響IVF/ICSI-ET助孕結(jié)局。本研究為拮抗劑方案鮮胚移植策略提供了一個(gè)新思路，對于拮抗劑方案D3胚胎移植后第3天E2下降幅度大于82.38%的患者，在取卵后應(yīng)額外補(bǔ)充E2加強(qiáng)黃體支持改善妊娠結(jié)局，但對于給藥時(shí)間、給藥途徑及用藥劑量等問題，未來仍需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行下一步臨床研究。