何志敏 宋天喜 胡剛 吳晶晶 仇志燁

自體骨被認(rèn)為是植骨的“金標(biāo)準(zhǔn)”，盡管優(yōu)勢突出，但其供骨部位的并發(fā)癥卻不容忽視。同種異體骨移植是治療骨缺損的另一個選擇，但也有疾病傳播和免疫排斥等并發(fā)癥[1-2]。因此，一些人工骨替代材料應(yīng)運而生。磷酸鈣陶瓷與骨有著相似的化學(xué)組成，但其溶解性影響破骨細(xì)胞的活性[3]，高分子聚合物具有生物活性但機械強度低[4]，傳統(tǒng)人工骨替代材料的缺點限制了其在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用。從我國已獲批準(zhǔn)上市的骨修復(fù)材料產(chǎn)品種類及注冊證數(shù)量看，人工合成材料產(chǎn)品在各細(xì)分領(lǐng)域多于異體骨和異種骨產(chǎn)品，體現(xiàn)了我國人工合成骨修復(fù)材料良好的發(fā)展態(tài)勢[5]，然而聚乳酸和礦化膠原復(fù)合的人工骨材料目前國內(nèi)還沒有取得注冊證的上市產(chǎn)品。

人體細(xì)胞外骨基質(zhì)含有無機礦物成分、膠原纖維和水，骨材料中使用的羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAp）在結(jié)構(gòu)上類似于骨基質(zhì)的無機礦物成分[6]。本研究利用膠原/羥基磷灰石（collagen/hydroxyapatite，COL/HAp）研發(fā)了新一代仿生骨替代材料礦化膠原，其成分和結(jié)構(gòu)與天然骨組織相似，具有很好的生物相容性和成骨活性，并逐漸應(yīng)用于臨床[7-8]。經(jīng)臨床反饋，需要對材料的生物相容性、生物力學(xué)性能和生物降解性進行優(yōu)化，使其達到最佳的生物適配效果，以提高骨缺損修復(fù)的臨床愈合率。雖然聚乳酸（polylactic acid，PLA）疏水性較強，細(xì)胞黏附能力和誘導(dǎo)成骨能力較差[9]，但其可降解，且有著優(yōu)異的生物相容性和機械性能，使其在生物醫(yī)用材料中應(yīng)用廣泛[10]。針對以上材料特點，本研究在礦化膠原人工骨修復(fù)材料的基礎(chǔ)上，引入聚乳酸制備復(fù)合支架材料，開發(fā)了聚乳酸/礦化膠原復(fù)合人工骨修復(fù)材料。

本研究使用聚乳酸和礦化膠原為原料，制備了聚乳酸/礦化膠原復(fù)合人工骨修復(fù)材料。雖然聚乳酸/礦化膠原復(fù)合材料有大量的研究，但是目前國內(nèi)并無已上市產(chǎn)品，也未有用于臨床應(yīng)用的產(chǎn)品。本研究的目的是采用自有專利技術(shù)制備材料，研究考察本材料在兔股骨髁松質(zhì)骨缺損模型上的骨修復(fù)情況，并對其安全性和有效性進行評價，為下一步聚乳酸/礦化膠原復(fù)合人工骨修復(fù)材料的臨床試驗及研究應(yīng)用提供依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

聚乳酸/礦化膠原復(fù)合人工骨修復(fù)材料（NBG），奧精醫(yī)療科技股份有限公司自主研發(fā)及生產(chǎn)，室溫保存。

聚乳酸/礦化膠原復(fù)合人工骨修復(fù)材料中礦化膠原與聚乳酸的質(zhì)量比為45∶55～60∶40，其中，礦化膠原中Ⅰ型膠原與羥基磷灰石的質(zhì)量比為10∶90～20∶80。此人工骨材料先以牛跟腱為原材料制備膠原蛋白，再進行體外礦化制備礦化膠原骨粉，然后將聚乳酸和礦化膠原通過特殊工藝共混，進行凍干造孔制備而成。材料的力學(xué)強度≥1.0 MPa，且具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙率≥70%，孔隙大小主要分布在25～600μm。

人工骨與兔自體髂骨（autologous graft bone，AGB）的混合比例為2∶1（即2 g人工骨修復(fù)材料使用1 g自體骨）。

1.2 實驗動物

4～5月齡普通級雄性新西蘭大白兔60只，平均（2.5±0.5）kg，由北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0003。

1.3 儀器設(shè)備

CT機（GE Lightspeed Ultra 16，美國）；X光機（SIEMENS AG，德國）；硬組織切片機（德國Leica公司）；光學(xué)顯微鏡（Olympus x71，日本）；萬能力學(xué)試驗機（AG-IC 100kN SHIMADZU，日本島津）。

1.4 實驗分組

將60只新西蘭大白兔，隨機分成5組，每組12只。實驗分為空白（Blank）組、人工骨（NBG）組、人工骨混骨髓（NBG+ABM）組、人工骨混自體骨（NBG+AGB）組、自體骨（AGB）組。實驗部位為股骨髁松質(zhì)骨區(qū)域。分別在4周、8周、12周對各組進行組織學(xué)、影像學(xué)評價，12周進行生物力學(xué)的評價。

1.5 實驗方法

速眠新耳緣靜脈麻醉后，無菌條件下取兔一側(cè)膝關(guān)節(jié)外側(cè)切口，顯露股骨外髁，切去骨膜。用直徑6 mm電鉆由外髁最寬大處中點為進點向內(nèi)髁方向制作約直徑6 mm、深度10 mm的松質(zhì)骨骨缺損，以探針探測穿通深度及是否穿透對側(cè)皮質(zhì)骨，骨缺損處植入對應(yīng)材料，填塞、壓實，關(guān)閉切口，同法進行對側(cè)股骨髁缺損填充。見圖1。

圖1 植入實驗的操作照片：A.電鉆制作骨缺損模型；B.確定缺損模型尺寸；C.缺損模型制作完成；D.植入材料

植入材料后不固定肢體，允許自由活動，連續(xù)3天肌肉注射青霉素G鈉預(yù)防感染。

1.6 實驗觀察與測試

1.6.1 影像學(xué)觀察

4.1.5 嚴(yán)格落實專間的相關(guān)衛(wèi)生制度，并符合下列要求：專間內(nèi)的工用具等所有設(shè)施設(shè)備必須專間專用，嚴(yán)格清洗消毒，防止出現(xiàn)物流交叉引起的污染；專間內(nèi)必須設(shè)置專人操作，不得在操作期間隨意進出專間，造成人流交叉引起的污染；確保操作時專間溫度在25℃以下；使用紫外消毒等方法每次使用前進行空氣消毒；使用專間二次更衣室進入專間，進入人員要穿戴專用工作衣、帽，清洗消毒手部。

分別于術(shù)后4周、8周、12周采用過量麻醉劑處死各實驗點兔子，完全剔除軟組織、肌肉。拍攝CT、X線片，X線片測試條件為距離100 cm、60 kVp及300 mA，曝光0.03 s，檢測骨缺損的修復(fù)情況。利用IPP6.0軟件對缺損區(qū)域灰度值進行定量，總共5個組別，n=3。

1.6.2 組織學(xué)觀察

切取股骨髁骨標(biāo)本，將標(biāo)本于4%的多聚甲醛中固定24 h。從股骨髁上1 cm左右去掉股骨干部分，將股骨髁沿著矢狀面使用硬組織切片機切成3～4 mm薄片。標(biāo)本薄片采用70%、90%、100%梯度乙醇脫水，10%EDTA脫鈣液脫鈣，樹脂包埋，分層切片后HE染色，光學(xué)顯微鏡100倍鏡下，沿著缺損4個垂直交叉方向視野隨機拍取圖片，觀察新生骨形成及骨缺損修復(fù)情況。

1.6.3 生物力學(xué)測試

植入后12周，取每組各3只兔股骨髁，修整成上下面平整的柱狀樣本（直徑10 mm×長度15 mm），取材時用生理鹽水持續(xù)沖洗，保持樣本濕潤與冷卻，-20℃冰箱保存。

樣本室溫解凍后，置于萬能力學(xué)試驗機載物臺緩慢加載（0.5 mm/min），直至組織出現(xiàn)破裂。記錄此時載荷大小、修復(fù)組織的應(yīng)變位移，計算載荷/應(yīng)變比值，將結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)觀察

X線圖片觀察顯示：第4周，空白組可見清晰缺損邊界，灰度值偏低，自體骨組、人工骨混自體骨組、人工骨混骨髓組、人工骨組缺損部位灰度較高，缺損邊界較空白組模糊。第8周，空白組與第4周時相比骨缺損灰度值無明顯升高，缺損面積無縮減，而自體骨組、人工骨混自體骨組、人工骨混骨髓組、人工骨組與第4周相比灰度值明顯升高，缺損面積明顯縮小。第12周，自體骨組缺損邊緣明顯模糊、消失，人工骨混自體骨組缺損區(qū)域也出現(xiàn)高密度骨組織修復(fù)影像表現(xiàn)，缺損邊緣消失，人工骨混骨髓組、人工骨組缺損邊緣較之前明顯縮小。具體見圖2。

圖2 骨缺損修復(fù)第4、8、12周的X線圖片

X線灰度值統(tǒng)計顯示：自體骨組與空白組，以及自體骨組與前一個時間點自身灰度值相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。第4周和第8周，5組X線灰度值進行組內(nèi)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在第4、8、12周每組間，人工骨組與自體骨組、人工骨混骨髓組、人工骨混自體骨組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。具體見圖3。

圖3 第4、8、12周5組的X線灰度值統(tǒng)計計算

CT三維重建圖顯示：第4周，自體骨修復(fù)效果較為明顯，人工骨混自體骨組、人工骨混骨髓組、人工骨組相對于空白組缺損區(qū)域明顯縮??；第8周，人工骨混自體骨組、人工骨混骨髓組、人工骨組相對于4周時缺損面積明顯縮小，自體骨缺損面積修復(fù)最明顯，僅剩缺損中央小塊部分被次高密度影覆蓋；第12周，人工骨混自體骨組、人工骨混骨髓組、人工骨組的缺損接近完全修復(fù)，修復(fù)效果明顯優(yōu)于空白對照組，自體骨組則完全修復(fù)。具體見圖4。

圖4 骨缺損修復(fù)第4、8、12周時的CT三維重建圖

2.2 組織學(xué)觀察

如圖5所示為5組材料在植入第4、8、12周后股骨髁的HE染色（×40）組織學(xué)觀察照片。第4周，人工骨組在缺損中央仍可見未降解的材料，材料空隙間有大量類骨質(zhì)和膠原結(jié)締組織填充，少量新生骨從缺損邊緣長入?？瞻捉M缺損邊緣清晰可見，缺損中央以炎性組織為主，稍有結(jié)締組織。第8周，人工骨組材料缺損處降解產(chǎn)物少見，主要被大片狀成熟骨和類骨質(zhì)及結(jié)締組織等填充，與自體骨骨修復(fù)效果相仿，無明顯差異。而人工骨混自體骨、人工骨混骨髓組材料部分降解，代替是大片新生骨修復(fù)填充?？瞻捉M則是主要以大片膠原結(jié)締組織填充，有小塊新生骨形成。第12周，人工骨組、自體骨組、人工骨混自體骨、人工骨混骨髓組缺損區(qū)域出現(xiàn)大面積成熟板層骨覆蓋，材料幾乎完全降解，缺損邊緣界限消失，缺損邊緣新生骨與缺損處既有骨緊密結(jié)合在一起，組間從新生骨面積、血管密度方面觀察無明顯差異?？瞻捉M缺損邊緣也出現(xiàn)新生骨，但缺損邊緣仍可見。

圖5 植入4、8、12周后股骨髁的組織學(xué)觀察（HE染色，×40）

2.3 生物力學(xué)測試

第12周，從實驗組和對照組股骨髁生物力學(xué)測試結(jié)果可見，人工骨組、人工骨混骨髓組、人工骨混自體骨組、自體骨組股骨髁最大壓力載荷較空白組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。人工骨組與自體骨組、人工骨混自體骨組、人工骨混骨髓組分別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 第12周股骨髁生物力學(xué)測試樣本的最大載荷

3 討論

聚乳酸/礦化膠原復(fù)合人工骨修復(fù)材料結(jié)合了聚乳酸和礦化膠原的優(yōu)點。復(fù)合材料中的膠原能促進成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等在材料表面的生長、擴散和增殖[11]，羥基磷灰石則增加了對成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力[12]。聚乳酸/礦化膠原復(fù)合人工骨修復(fù)材料不僅具有良好的機械強度、骨傳導(dǎo)性和生物相容性，還具有相互連接的多孔空間，有利于成骨細(xì)胞、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的運輸[13]。人的骨基質(zhì)圍繞血管在空間里呈網(wǎng)狀排列，形成很多相互連接的孔隙[14]。人骨小梁的孔隙率為40%～95%，且當(dāng)支架孔隙直徑在100～500μm時有利于骨整合[15-16]。本研究制備的人工骨復(fù)合材料具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙率≥70%，有利于成骨細(xì)胞和血管向內(nèi)生長，能滿足臨床骨修復(fù)需求。

本實驗表明，除空白組骨缺損部位有少量骨質(zhì)瘢痕出現(xiàn)外，其余4組均能在術(shù)后12周內(nèi)實現(xiàn)骨質(zhì)愈合。實驗組的新生骨和周圍骨質(zhì)彼此結(jié)合，X光和CT三維重建顯示，自體骨（AGB）組、人工骨混自體骨（NBG+AGB）組、人工骨混骨髓（NBG+ABM）組、人工骨（NBG）組的修復(fù)效果依次降低，但都接近完全修復(fù)。組織學(xué)切片觀察顯示，除空白組外，其余組材料已完全降解。生物力學(xué)測試表明，自體骨組機械強度最高，但其余實驗組的機械強度接近自體骨組。實驗期間，5組動物無明顯臨床異常，也無動物死亡。于各考察時間點解剖動物，手術(shù)部位無可見形態(tài)變化，病理組織學(xué)檢查未見感染性炎癥反應(yīng)。

植入后4周、8周、12周，缺損區(qū)表面觀察及與股骨髁間線垂直剖面切開觀察骨缺損修復(fù)情況。結(jié)合切開骨缺損部分直接觀察及專業(yè)醫(yī)生的手觸，實驗組均表現(xiàn)了良好的骨愈合，新生骨與周圍骨質(zhì)彼此結(jié)合，與周圍骨質(zhì)界限變模糊；自體骨組難以區(qū)分新生骨與周圍骨質(zhì)界限，彼此之間結(jié)合牢固；空白組骨愈合效果較差。

礦化膠原在組成和層次結(jié)構(gòu)上與自然骨高度相似而備受關(guān)注，它能為骨細(xì)胞成骨過程提供良好的微環(huán)境，有利于引導(dǎo)骨組織再生。礦化膠原復(fù)合材料在提供成骨微環(huán)境的同時，也能促進人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化。生物材料移植物在體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，是植入物能否發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素。過重的炎癥可導(dǎo)致纖維黏連、瘢痕形成和“材料-骨”結(jié)合失敗，而適度炎癥產(chǎn)生的趨化因子和生長因子有助于誘導(dǎo)成骨分化和新生血管形成，礦化膠原復(fù)合材料具有降低支架炎癥反應(yīng)的優(yōu)點，在與機體免疫系統(tǒng)的相互作用中能取得很好的平衡[17]。聚乳酸/礦化膠原復(fù)合人工骨修復(fù)材料的原料之一聚乳酸（PLA），是被FDA批準(zhǔn)用于生物醫(yī)學(xué)的合成聚合物之一[18-19]。PLA雖具有很好的生物相容性和生物降解性，但會產(chǎn)生酸性降解產(chǎn)物，骨的一些成分可能會因此溶解[20]。研究表明，在PLA基質(zhì)中添加COL/HAp，可以緩沖PLA降解產(chǎn)物引起的局部pH下降，調(diào)節(jié)其降解速率，進而提高細(xì)胞黏附性、力學(xué)性能[21-22]。

本實驗采用兔股骨髁松質(zhì)骨模型，觀察期限適中，樣本含量合理，通過不同的結(jié)果測試，證明了聚乳酸/礦化膠原復(fù)合人工骨修復(fù)材料優(yōu)良的生物相容性，生物降解性和骨傳導(dǎo)性，并具有一定的力學(xué)性能，可以取得很好的骨修復(fù)效果。人工骨復(fù)合材料可以通過生物安全的原材料合成制備，沒有供應(yīng)不足的問題，并且材料具有一定的孔隙率和力學(xué)強度，解決了自體骨來源有限的問題。

盡管如此，對于聚乳酸/礦化膠原復(fù)合人工骨修復(fù)材料性能的解釋必須謹(jǐn)慎，還應(yīng)考慮到本實驗的一些限制。首先，實驗動物均選用雄性，可能會造成一定的誤差。松質(zhì)骨的孔隙度和性別具有相關(guān)性[23]。雌激素對骨修復(fù)的影響，以及對材料降解的作用機制有待闡明。其次，可以考慮增加第4周和第8周的生物力學(xué)測試。當(dāng)人體在植入支架進行骨缺損修復(fù)的過程中，需要一定的主動或被動運動來避免肌肉萎縮，同時加快血液循環(huán)。若能測試骨修復(fù)不同階段材料的機械強度，有助于指導(dǎo)患者的康復(fù)訓(xùn)練，為負(fù)荷強度提供參考價值。

總之，在新西蘭兔標(biāo)準(zhǔn)尺寸股骨髁缺陷缺損模型的動物實驗數(shù)據(jù)分析得出，制備的聚乳酸/礦化膠原復(fù)合人工骨修復(fù)材料在臨床上可單獨使用，也可以混合自體骨髓植入，或者混合自體骨植入，可以促進骨修復(fù)和骨再生，可有效地代替單純自體骨移植引起的并發(fā)癥。本動物試驗研究證明了材料的安全性和有效性，為后續(xù)臨床試驗和應(yīng)用提供了有效證據(jù)。