潘 琪,王子珍,葉富躍,邢 偉,林家漢,盧剪月,楊 堃

（1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科，海南 海口570102；2.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科，海南 ?？?70102）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見于中老年人的神經系統(tǒng)變性疾病，以靜止性震顫、運動緩慢、肌強直和姿勢步態(tài)障礙為癥狀特征，以黑質多巴胺能神經元變性和紋狀體內多巴胺嚴重減少為病理學特征，其發(fā)病機制尚未完全清楚［1-2］。研 究［3］顯 示：泛 素-蛋 白酶 體 系 統(tǒng) 受 損 與PD的發(fā)生有密切關系。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細胞中重要的非溶酶體蛋白質降解系統(tǒng)，參與細胞中大多數蛋白質的降解［4］。蛋白酶體抑制劑能夠誘導多巴胺能神經元退變和包涵體形成，類似于PD的病理特征，但其中的機制尚未完全明確［5-6］。早期研究［7-9］顯示：氧化損傷可能是導致PD神經元死亡的重要因素之一。體外研究［10］顯示：抑制蛋白酶體會導致細胞出現氧化損傷。但相關研究較少，且體內抑制蛋白酶體對黑質多巴胺能神經元的氧化損傷作用尚不明確。本研究采用立體定向手術將蛋白酶體抑制劑乳胞素注射入大鼠黑質中，于注射后不同時間點檢測大鼠中腦黑質中的羥自由基、還原型谷 胱 甘 肽 （glutathione， GSH）、 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）、蛋白質羰基和8-羥基脫 氧 鳥 苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）等氧化損傷指標及黑質中多巴胺能神經元退變情況，探討體內氧化損傷在蛋白酶體抑制劑誘導多巴胺能神經元死亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器健康雄性SD大鼠70只由海南醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（瓊）2017-0013，體質量200～250 g，室溫22℃±2℃，光線12 h明暗交替，自由飲水飲食。所有操作均符合實驗動物倫理學要求。乳胞素、小鼠抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）單克隆抗體和阿撲嗎啡購自美國Sigma公司，免疫組織化學檢測試劑盒（SP-9002）和DAB顯色試劑盒（ZLI-9032）購自北京中杉金橋生物技術有限公司，羥自由基測試試劑盒、GSH測定試劑盒、MDA測定試劑盒、蛋白質羰基水平測定試劑盒和8-OHdG測試盒購自南京建成生物工程研究所。大鼠立體定向儀（51603型）購自美國Stoelting公司，圖像分析系統(tǒng)（NIKON 801圖像分析系統(tǒng)）購自日本尼康公司，冰凍切片機（CM 1900）購自德國Leica公司，酶標儀（Synergy H 1M）購自美國Bio-Tek公司。

1.2 動物分組和黑質乳胞素注射將70只SD大鼠隨機分為乳胞素組和生理鹽水組，每組35只，經反復行為檢測確認其無旋轉行為后進行實驗。3.5%水合氯醛（350 mg·kg－1）腹腔注射麻醉動物后固定在立體定向儀上，齒桿較耳桿低2.4 mm，確定各組大鼠右側黑質致密部為前囟后5.2 mm，矢狀縫右側2.2 mm，硬膜下7.2 mm，切開顱部皮膚，小型磨鉆鉆開顱骨，按已確定的坐標將微量注射器緩慢進針至預定深度，注射2μL乳胞素10μg（生理鹽水溶解），注射速度為0.5μL·min－1，留針5 min，緩慢退針，縫合切口。生理鹽水組大鼠按照相同方法注射等體積的生理鹽水。

1.3 曠場實驗檢測2組大鼠運動能力干預后21 d行曠場實驗檢測2組大鼠運動能力［11］。曠場實驗箱：黑色敞口木箱，大小為60 cm×60 cm×40 cm，箱底劃為25個方格（12 cm×12 cm），將大鼠置入正中一格，10 s后開始記錄15 min內2組大鼠各項行為指標。總跑動時間：大鼠軀干處于水平位置時向前后或兩側運動的時間；下肢站立次數：雙前肢抬起離地1 cm以上的次數；穿梭距離：規(guī)定時間內跑動的格子數（二爪以上跨入鄰格為跑動1格）；實驗在17：00～22：00進行，實驗室內暗光、安靜，2次實驗之間將箱底打掃干凈。

1.4 不對稱實驗檢查大鼠行為能力將大鼠置入透明塑料圓柱筒（直徑20 cm，高30 cm）中，錄像記錄大鼠在筒內的行為。測試時間為10 min。在暗光環(huán)境下進行測試［12］。測試完成后，由不了解大鼠狀況的研究人員通過錄像對大鼠行為進行記分和評分。評分方法為計算不對稱指數，不對稱指數=（同側觸壁次數+1/2雙側觸壁次數）/（同側觸壁次數+對側觸壁次數+雙側觸壁次數）。

1.5 阿撲嗎啡誘導旋轉實驗檢測各組大鼠運動行為曠場實驗后進行阿撲嗎啡誘導旋轉實驗［13］。大鼠皮下注射阿撲嗎啡（0.25 mg·kg－1）后置于圓形測試容器中，10 min后開始觀察大鼠旋轉行為的改變，記錄30 min內大鼠的對側旋轉圈數。

1.6 黑質氧化損傷指標檢測干預后第3、7和21 d，采用8%水合氯醛（400 mg·kg－1）對大鼠進行深度麻醉，快速斷頭取腦，在冰臺上分離出新鮮黑質，采用4℃PBS沖洗除去殘余血液，在干冰上用濾紙拭干，立即置于－80℃超低溫冰箱備用。取組織塊采用4℃PBS漂洗，濾紙拭干，準確稱質量，采用眼科剪快速剪碎組織塊，按質量（g）：體積（mL）=1∶9的比例，加入4℃預冷的生理鹽水中，組織勻漿器充分勻漿，3 000 r·min－1、4℃離心15 min，將離心好的勻漿取上清棄去下面沉淀。羥自由基、GSH、MDA、蛋白質羰基和8-OHd G水平檢測的具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 黑質TH免疫組織化學染色和神經元計數干預后 21 d，8% 水合氯醛深度麻醉（400 mg·kg－1）大鼠，然后將大鼠固定于實驗板上。充分暴露心臟，持針頭刺入左心室，剪開右心耳，快速灌注生理鹽水，300 mL/只，將灌注液更換為4%多聚甲醛400 mL。斷頭取腦，采用4%多聚甲醛后固定6 h。冰凍切片，片厚30μm。按免疫組織化學檢測工作液試劑盒說明行TH免疫組織化學染色。小鼠抗TH一抗稀釋比例為1∶1 000。每只大鼠取前囟后－4.8 mm、－5.2 mm和－5.6 mm的切片各1張，共3張切片，然后對兩側黑質的TH免疫陽性神經元進行計數。黑質多巴胺能神經元毀損程度采用黑質中TH免疫陽性神經元殘存率表示，殘存率越低，毀損程度越高。每只大鼠黑質中TH免疫陽性神經元殘存率為毀損側與健側的TH免疫陽性神經元百分率。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。2組大鼠旋轉圈數、穿梭距離、下肢站立的次數、總跑動時間和羥自由基、GSH、MDA、蛋白質羰基及8-OHdG水平分布符合正態(tài)分布，以±s表示，組間兩兩比較采用LSDt法。2組大鼠不對稱指數和神經元殘存率以±s表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 曠場實驗檢測2組大鼠運動能力干預21 d后，乳胞素組大鼠跑動減少、運動緩慢，穿梭距離明顯低于生理鹽水組（P＜0.05）。乳胞素組大鼠15 min內下肢站立次數與生理鹽水組比較亦明顯減少（P＜0.05）。生理鹽水組大鼠跑動活躍，平均有近一半的時間均在跑動，而乳胞素組大鼠跑動較少，總跑動時間較生理鹽水組減少（P＜0.05）。見表1。

表1 2組大鼠曠場實驗相關指標Tab.1 Indicators of open field test of rats in two groups

2.2 2組大鼠行為能力干預21 d后，生理鹽水組大鼠前肢使用不對稱指數為0.51，位于0.5附近，表明大鼠對兩側前肢的使用無偏好。乳胞素組大鼠前肢使用不對稱指數為0.81，明顯大于0.5，表明大鼠偏好使用毀損同側肢體。與生理鹽水組比較，乳胞素組大鼠前肢使用不對稱指數明顯升高（t=－11.155，P＜0.05）。

2.3 2組大鼠旋轉行為表現干預21 d后，乳胞素組大鼠注射阿撲嗎啡后出現恒向健側旋轉，表現為以健側后肢為支撐點，頭尾相接，身體彎曲成環(huán)狀的快速旋轉行為。第3、7和21天30 min內大鼠旋轉圈數分別為（17.9±11.3）、（27.6±18.8）和（260.4±22.2）圈，與生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），第21天大鼠旋轉圈數較前2次（第3天和第7天時）的旋轉圈數明顯增多（P＜0.05），而第7天大鼠旋轉圈數與第3天的旋轉圈數比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.239）。生理鹽水組大鼠注射阿撲嗎啡后無旋轉行為。

2.4 2組大鼠黑質氧化損傷指標干預7和21 d后，與生理鹽水組比較，乳胞素組大鼠右側黑質中羥自由基水平明顯升高（P＜0.05），而GSH水平明顯降低（P＜0.05）。干預7和21 d后，與生理鹽水組比較，乳胞素組大鼠右側黑質中MDA、蛋白質羰基和8-OHd G水平明顯升高（P＜0.05）。干預3 d后，2組大鼠右側黑質中羥自由基、GSH、MDA、蛋白質羰基和8-OHd G水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2和3。

表2 不同時間點2組大鼠右側黑質中羥自由基和GSH水平Tab.2 Levels of hydroxyl radical and GSH in right substantia nigra of rats in two groups (n=7，±s）

表2 不同時間點2組大鼠右側黑質中羥自由基和GSH水平Tab.2 Levels of hydroxyl radical and GSH in right substantia nigra of rats in two groups (n=7，±s）

*P＜0.05 compared with normal saline group.

表3 不同時間點2組大鼠右側黑質中MDA、蛋白質羰基和8-OHd G水平Tab.3 Levels of MDA,protein carbonyl and 8-OHdG in right substantia nigra of rats in two groups (n=7，±s）

表3 不同時間點2組大鼠右側黑質中MDA、蛋白質羰基和8-OHd G水平Tab.3 Levels of MDA,protein carbonyl and 8-OHdG in right substantia nigra of rats in two groups (n=7，±s）

*P＜0.05 compared with normal saline group.

2.5 2組大鼠黑質中TH免疫陽性神經元殘存率干預21 d后，生理鹽水組大鼠兩側黑質中均有大量的TH免疫陽性神經元。乳胞素組大鼠毀損側（右側）黑質中TH免疫陽性神經元明顯喪失。生理鹽水組和乳胞素組大鼠黑質中TH免疫陽性神經元殘存率分別為（98.48%±3.16%）和（10.91%±1.77%）。與生理鹽水組比較，乳胞素組大鼠黑質中TH免疫陽性神經元殘存率明顯降低（t=59.263，P＜0.05）。乳胞素組大鼠毀損側黑質中TH免疫陽性神經元數較對側平均減少約89.09%。見圖1。

圖1 2組大鼠黑質中TH免疫組織化學染色情況（Bar=1 mm）Fig.1 TH immunohistochemical staining in substantia nigra of rats in two groups(Bar=1 mm)

3 討 論

本研究結果顯示：將蛋白酶體抑制劑乳胞素注射入大鼠黑質后，黑質中羥自由基、MDA、蛋白質羰基和8-OHd G水平明顯升高，而GSH水平明顯降低。組織中羥自由基和GSH水平是反映組織氧化還原狀態(tài)的常用標志物［14-15］。大鼠黑質中注射乳胞素后第7和21天，黑質中羥自由基水平明顯升高，而GSH水平明顯降低，表明乳胞素誘導大鼠黑質組織出現嚴重的氧化應激反應。MDA、蛋白質羰基和8-OHdG分別是脂質、蛋白質和DNA氧化損傷的常用生物標志物［16-17］。大鼠黑質內注射乳胞素后第7和21天，MDA、蛋白質羰基和8-OHd G水平均出現明顯升高，表明乳胞素誘導黑質內脂質、蛋白質和DNA均出現嚴重的氧化損傷。這些發(fā)現與先前的多項體外研究結果一致。抑制蛋白酶體可以導致NT-2細胞和SK-N-MC細胞氧化損傷，包括蛋白質、脂質和DNA的氧化損傷水平升高及GSH水平降低［18］。有研究［19］顯示：抑制蛋白酶體可引起神經元和星形膠質細胞的DNA和RNA的氧化損傷。有研究［18］顯示：蛋白酶體抑制劑誘導的氧化損傷早于細胞死亡，提示蛋白酶體抑制劑通過誘導神經元氧化損傷，從而導致神經元死亡。蛋白酶體抑制劑誘導神經元氧化損傷的機制尚不完全明確，可能與氧化損傷的蛋白質降解減少、線粒體功能受損和鐵離子失穩(wěn)態(tài)等有關［20-21］，還需要進一步研究。本研究中，在注射乳胞素第3天時大鼠黑質組織中未檢測出氧化應激標志物的明顯改變，提示體內抑制蛋白酶體誘導神經元氧化損傷需要較長的時間。

本研究結果顯示：2μL、5 g·L－1蛋白酶體抑制劑乳胞素單側黑質內微量注射可以導致大鼠黑質中TH免疫陽性神經元大量喪失。TH是多巴胺能神經元的常用標志物，黑質中TH免疫陽性神經元大量喪失反映出黑質內多巴胺能神經元大量死亡。乳胞素組大鼠毀損側黑質內TH免疫陽性神經元數較對側平均減少約89.09%，表明2μL、5 g·L－1乳胞素單側黑質內注射可以達到嚴重毀損一側黑質-紋狀體多巴胺能神經通路。乳胞素組大鼠在曠場測試中表現出明顯的運動減少和運動緩慢癥狀，在前肢采用不對稱測試中偏好使用毀損同側肢體，在阿撲嗎啡誘導旋轉實驗中注射阿撲嗎啡后出現恒向健側旋轉，表明這些類似于PD的運動障礙表現能夠被相關行為學測試檢測出。以上研究結果支持蛋白酶體抑制劑可以用于PD動物模型的建立。

綜上所述，大鼠黑質中注射蛋白酶體抑制劑可以誘導大鼠多巴胺能神經元氧化損傷和死亡，大鼠能夠表現出類似于PD的運動障礙表現，氧化損傷在蛋白酶體抑制劑誘導多巴胺能神經元死亡中起重要作用。