楊明星,董 文,李 冀

（海南省腫瘤醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南 ?？?570312）

肺癌是世界上最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷升高，且預(yù)后較差［1］?？沟蛲鍪悄[瘤細(xì)胞的重要特征，也是導(dǎo)致抗腫瘤治療失敗的主要原因之一［2］。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）是MAPK超家族中的重要成員，屬于應(yīng)激激活蛋白激酶，可參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化等過(guò)程的調(diào)控。有研究［3-4］顯示：激活p38 MAPK通路可抑制肺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，而抑制p38 MAPK通路活化可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的干性維持，表明p38 MAPK可能是治療肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。貝母素乙（peiminine，PMI）是由貝母鱗莖中提取的一種天然化合物，不僅具有清熱散結(jié)和化痰止咳的功效，還具有抗腫瘤作用。研究［5-6］顯示：PMI不僅具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用，還具有化療增敏作用。PMI在肺癌中的抗腫瘤作用及其相關(guān)分子機(jī)制尚不清楚。本研究采用不同濃度PMI聯(lián)合p38 MAPK抑制劑SB203580處理肺癌A 549細(xì)胞，探討PMI對(duì)A 549細(xì)胞凋亡的影響，并闡述其可能的分子機(jī)制，為治療肺癌提供可靠的新藥靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人肺癌A 549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。PMI（純度≥98%，批號(hào)：SPB150）購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司。p38 MAPK抑制劑 SB203580購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司，胎牛血清和PRMI1640購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，MTT試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，兔抗p53、B細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和cleaved-caspase-3購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK）、磷酸 化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK，p-p38 MAPK）（Thr180/Thr182）、小鼠雙微體2（murine double minute 2，MDM 2）、p-p53（ser15）、p53上凋凋亡調(diào)節(jié)因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）和β-actin抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。FC500流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman-Coulter公司，CX-21熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，Tanon2500凝膠成像儀和蛋白電泳儀購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將人肺癌A 549細(xì)胞接種至含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。嚴(yán)格觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%時(shí)，加入胰蛋白酶消化，按1∶3進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組A 549細(xì)胞存活率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肺癌A 549細(xì)胞，以每孔4×103個(gè)細(xì)胞的密度接種至96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全貼壁后加入不同濃度（0.025、0.050、0.100、0.200和0.400 mmol·L－1）PMI分 別 處 理24、48和72 h。距離藥物處理時(shí)間結(jié)束前4 h，每孔加入5 g·L－1MTT溶液10μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基后每孔加入150μL DMSO，避光低速振蕩10 min，于酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值－空白組A值）/（對(duì)照組A值－空白組A值）×100%［7］，并計(jì)算各組的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值。IC50=lg－1［Xm－i（ΣP－0.5）］，Xm：設(shè)計(jì)的最大濃度的對(duì)數(shù)值；i：各濃度倍比濃度的對(duì)數(shù)值；ΣP：各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率之和。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A 549細(xì)胞，以0、0.050、0.100和 0.200 mmol·L－1PMI或0.200 mmol·L－1PMI聯(lián) 合SB203580（20μmol·L－1）處理A 549細(xì)胞48 h，分為空白對(duì)照組、不同濃度（0.050、0.100和0.200 mmol·L－1）PMI組 和聯(lián) 合 組（0.200 mmol·L－1PMI+20μmol·L－1SB203580）。根據(jù)細(xì)胞分組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.5 AnnexinⅤ-FITC/PI法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率細(xì)胞分組處理后培養(yǎng)48 h，加入0.25%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，采用預(yù)冷的PBS洗滌后，加入Binding Buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106mL－1。取100μL細(xì)胞懸浮液，加入5μL AnnexinⅤ-FITC，室溫避光孵育10 min后，再加入5μL PI室溫避光孵育5 min，采用PBS定量至500μL，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組A 549細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blotting法檢測(cè)各組A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白和p38 MAPK/p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平分組處理后培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入0.25%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞沉淀，加入含磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，4℃、12 000 r·min－1離心15 min，取上清，然后采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備10%SDSPAGE膠，每孔30μg蛋白，95℃變性5 min后上樣電泳。完成電泳后，將目的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，室溫?fù)u床封閉2 h。采用含0.05%吐溫-20的Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）洗滌3次，每次5 min。滴加相應(yīng)一抗Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶2 000）和cleaved-caspase-3（1∶500）；p38MAPK（1∶1 000）、p-p38MAPK（Thr180/Thr182）（1∶1 000）、MDM 2（1∶1 000）、p53（1∶1 000）、p-p53（ser15）（1∶500）、PUMA（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次5 min，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液，室溫孵育1 h，TBST室溫?fù)u床脫色洗滌3次，每次5 min。ECL發(fā)光顯影后，采用Image J掃描并分析目的蛋白灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組A549細(xì)胞中p53蛋白定位情況取對(duì)數(shù)期A 549細(xì)胞，接種至內(nèi)含無(wú)菌載玻片的6孔板中，分組處理并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，加入0.5%聚乙二醇辛基苯基醚室溫通透細(xì)胞10 min，PBS洗滌3次，加入含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h，滴加一抗p53（1∶100）4℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次，再加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，避光滴加適量DAPI染液，PBS洗滌3次，最后采用抗熒光淬滅試劑封片，熒光顯微鏡下觀察p53蛋白定位情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。人肺癌A 549細(xì)胞存活率，細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞中Bax、cleaved-caspase-3、Bcl-2、p-p38MAPK（Thr180/Thr182）、p-p53（ser15）、p53、PUMA和MDM 2蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNKq檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組人肺癌A 549細(xì)胞存活率和IC 50值和細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，不同濃度PMI處理均能有效降低肺癌A 549細(xì)胞存活率，且與時(shí)間和濃度呈依賴性。不同濃度（0、0.025、0.050、0.100、0.200和0.400 mmol·L－1）PMI處理A 549細(xì)胞24、48和72 h，其IC50值分別為（0.53±0.028）、（0.29±0.025）和（0.12±0.011）mmol·L－1，后 續(xù) 選 擇PMI的 處 理 濃 度 為0.05、0.10和0.20 mmol·L－1，處理時(shí)間為48 h。見(jiàn)圖1。

圖1 MTT法檢測(cè)各組人肺癌A549細(xì)胞存活率Fig.1 Survival rates of human lung cancer A 549 cells in various groups detected by MTT assay

2.2 各組人肺癌A 549細(xì)胞中凋亡率和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，不同濃度（0.05、0.10和0.20 mmol·L－1）PMI處理48 h后，A 549細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性升高（P＜0.05），且促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。與0.20 mmol·L－1PMI組比較，聯(lián)合組A 549細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2～4。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組人肺癌A549細(xì)胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of human lung cancer A 549 cells in various groups detected by flow cytometry

圖3 各組人肺癌A549細(xì)胞凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of human lung cancer A 549 cells in various groups

2.3 各組人肺癌A 549細(xì)胞中p38 MAPK/p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，處理48 h后，不 同 濃 度（0.05、0.10和0.20 mmol·L－1）PMI組A 549細(xì)胞中p-p38MAPK、p-p53（ser15）、p53和PUMA蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），而MDM 2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與0.20 mmol·L－1PMI組比較，聯(lián)合組A 549細(xì)胞中p-p38MAPK、p-p53（ser15）、p53和PUMA蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），而MDM 2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 Western blotting法檢測(cè)人肺癌A 549細(xì)胞p38 MAPK/p53信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.5 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of p38 MAPK/p53 signaling pathway related proteins in human lung cancer A 549 cells detected by Western blotting method

圖4 各組人肺癌A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.4 Electrophoregram (A) and histogram(B) of expressions of apoptosis-related proteins in human lung cancer A 549 cells in various groups detected by Western blotting method

2.4 各組人肺癌A 549細(xì)胞中p53蛋白核轉(zhuǎn)位情況免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：各組A 549細(xì)胞均表達(dá)p53蛋白，其中對(duì)照組和0.05 mmol·L－1PMI組A 549細(xì)胞中p53蛋白綠色熒光較弱，其他3組A 549細(xì)胞中p53蛋白綠色熒光較強(qiáng)；與對(duì)照組比較，處理48 h后，不同濃度（0.05、0.10和0.20 mmol·L－1）PMI組A 549細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)水平有升高趨勢(shì)，且有p53蛋白由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。與0.20 mmol·L－1PMI組比較，聯(lián)合組A 549細(xì)胞中p53蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達(dá)。見(jiàn)圖6。

圖6 各組A549細(xì)胞中p53蛋白定位情況（免疫熒光，×400）Fig.6 Localization of p53 protein in A 549 cells in various groups(Immunofluorescence,×400)

3 討 論

PMI是從中藥貝母中提取的生物堿，具有鎮(zhèn)咳祛痰和鎮(zhèn)痛抗炎等多種藥理作用［8］。研究［9-10］顯示：PMI對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，還可通過(guò)抑制MEK/ERK的磷酸化水平，抑制柯薩奇B病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞的凋亡和緩解細(xì)胞炎癥水平。PMI通過(guò)調(diào)控EGFR/FAK通路活性，抑制阿霉素處理的胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提高其對(duì)化療藥物的敏感性［11］。PMI通過(guò)LINC00659/miR-760軸抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的存活、集落形成和轉(zhuǎn)移，從而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生［12］。上述研究結(jié)果均提示：PMI對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示：PMI可以明顯抑制人肺癌A 549細(xì)胞增殖活性，且呈濃度依賴性。根據(jù)各組細(xì)胞的IC50值，選擇0.05、0.10和0.20 mmol·L－1和48 h作為PMI處理濃度和時(shí)間。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種基本機(jī)制，可被多種細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)損傷激活。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物的重要標(biāo)志之一，抗癌藥物通常經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤發(fā)展［13-15］。研究［16］顯示：白藜蘆醇通過(guò)阻滯細(xì)胞周期、調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)及線粒體細(xì)胞凋亡途徑，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡水平，是臨床抗腫瘤的潛在應(yīng)用藥物。迷迭香酸衍生物RAD-9通過(guò)調(diào)控p38 MAPK信號(hào)通路活性誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡［17］。大黃活性成分Danthron可通過(guò)抑制自噬增強(qiáng)阿霉素對(duì)胰腺癌細(xì)胞的毒性，提高藥物敏感性［18］。上述研究結(jié)果說(shuō)明：抗腫瘤藥物通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)途徑，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡水平，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的效果。本研究結(jié)果顯示：PMI通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白表達(dá)和抑制抗凋亡蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)人肺癌A 549細(xì)胞的凋亡；說(shuō)明PMI可能是治療肺癌的有效抗癌藥物，但PMI促進(jìn)肺癌A 549細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制尚不明確。MAPK是細(xì)胞信號(hào)傳遞者，將信號(hào)由細(xì)胞表面?zhèn)鬟f至細(xì)胞核內(nèi)，具有三級(jí)激酶模式，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等一系列生理病理過(guò)程。p38作為MAPK的4大亞族之一，參與調(diào)節(jié)多種 腫 瘤 細(xì) 胞 凋 亡 過(guò) 程［19-20］。研 究［21］顯 示：RND2作為p38 MAPK磷酸化復(fù)合物的內(nèi)源性阻遏物，抑制p38 MAPK信號(hào)通路活性，進(jìn)而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬和凋亡，誘導(dǎo)異種移植小鼠腫瘤生長(zhǎng)。維生素E衍生的生育三烯酚通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬途徑促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡，且該抗腫瘤效用與JNK和p38信號(hào)通路活性相關(guān)［22］，但p38 MAPK信號(hào)通路是否參與了PMI對(duì)人肺癌A 549細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用尚未知。本研究結(jié)果表明：p38 MAPK抑制劑SB203580能明顯抵抗PMI對(duì)人肺癌A 549細(xì)胞的促凋亡作用，說(shuō)明PMI對(duì)A 549細(xì)胞的促凋亡作用與p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活相關(guān)。

促凋亡的p53信號(hào)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，參與血管生成、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞存活［23］。研究［24］顯示：白桑椹抗氧化成分的抑瘤作用可能是通過(guò)激活p53信號(hào)，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞能否發(fā)生凋亡，部分取決于介導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)（p53和Bax）與抗凋亡的蛋白質(zhì)（Bcl-2）之間的平衡。研究［25］顯示：在肺癌A 549細(xì)胞中p53表達(dá)上凋，p53的上調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞Bcl-2表達(dá)下調(diào)，降低Bcl-2/Bax比值，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，p53作為p38 MAPK信號(hào)通路下游的重要因子，對(duì)細(xì)胞凋亡具有決定作用。MDM 2屬于泛肽連接酶，可將p53泛肽化，促使p53被蛋白酶降解，與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明：PMI通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)通路，加速M(fèi)DM 2蛋白降解，促進(jìn)p53蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致p53蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)位，激活下游p53介導(dǎo)的凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，PMI通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)p53的表達(dá)及核轉(zhuǎn)位，最終導(dǎo)致p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑被激活，誘導(dǎo)A 549細(xì)胞凋亡。