杜元良,任 旺,劉 琳,胡朔丹,劉茗宇,杜鵬飛,付秀美,3

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨外科，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000；3.河北省神經(jīng)損傷與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000）

背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）即脊神經(jīng)節(jié)，是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元胞體聚集而形成的結(jié)構(gòu)，位于椎間孔處，是脊神經(jīng)后根與前根匯合成脊神經(jīng)之前膨大的部分，為感覺神經(jīng)元胞體所集聚的部位。DRG細(xì)胞生存能力較強(qiáng)，體外培養(yǎng)的成功率較高，因此關(guān)于DRG細(xì)胞的基礎(chǔ)和臨床研究［1］較多。施萬(wàn)細(xì)胞（Schwann cells，SCs）是周圍神經(jīng)的膠質(zhì)細(xì)胞，在周圍神經(jīng)損傷（peripheral nerve injury，PNI）后的再生修復(fù)過(guò)程中可以發(fā)揮誘導(dǎo)再生、營(yíng)養(yǎng)支持和促進(jìn)軸突生長(zhǎng)等作用［2-3］。然而，體外培養(yǎng)SCs卻存在來(lái)源困難、擴(kuò)增緩慢和易受污染等不足［4］。脂肪源性干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）源于脂肪組織，含有大量的細(xì)胞基質(zhì)成分，其來(lái)源充分、取材方便、體外培養(yǎng)增殖速度快且擴(kuò)增能力強(qiáng)［5-6］。本課題組前期研究［7］證實(shí)：ADSCs可在體外經(jīng)多種因子聯(lián)合誘導(dǎo)，分化為施萬(wàn)細(xì)胞樣細(xì)胞（Schwann cell-like cells，SCLCs）。這不僅避免了SCs的缺點(diǎn)，還能充分發(fā)揮SCs在PNI后的再生修復(fù)作用，這將對(duì)周圍神經(jīng)的再生修復(fù)起到極大的促進(jìn)作用。HAN等［8］研究顯示：將DRG細(xì)胞接種于載有分化后ADSCs（即形成為SCLCs）的碳納米管上，其細(xì)胞數(shù)量及每個(gè)細(xì)胞的最長(zhǎng)軸突均明顯高于單獨(dú)的碳納米管。但關(guān)于SCLCs對(duì)DRG細(xì)胞的作用機(jī)制目前尚不十分清楚。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）具有營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生的作用［9-10］。研究［11］顯示：NGF與其細(xì)胞膜上的受體結(jié)合是啟動(dòng)感覺神經(jīng)元分化、生長(zhǎng)和存活過(guò)程的主要因素。本研究通過(guò)建立SCLCs與DRG細(xì)胞共培養(yǎng)體系，觀察DRG細(xì)胞及其突起數(shù)的變化并檢測(cè)DRG細(xì)胞中NGF蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步探討SCLCs促進(jìn)DRG細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及其可能的作用機(jī)制，為采用細(xì)胞移植方式治療PNI提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器SPF級(jí)健康Sprague-Dawley（SD）大鼠購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。10只體質(zhì)量為80～120 g的雄性SD大鼠用于ADSCs的分離與培養(yǎng)；6只雌性和2只雄性SD大鼠（體質(zhì)量為180～220 g）進(jìn)行合籠喂養(yǎng)，待幼鼠出生后，取出生1～3 d的幼鼠用于DRG細(xì)胞的培養(yǎng)。本研究經(jīng)過(guò)承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：CDMCLAC-20190402-007，實(shí)驗(yàn)過(guò)程及操作均符合國(guó)家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Genview公司，0.25%胰酶-EDTA和Ⅰ型膠原酶購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)于以色列BI公司，地塞米松、茜素紅、β-甘油磷酸鈉、維生素C、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）和全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，佛司可林（forskolin，F(xiàn)SK）購(gòu)于美國(guó)Alexis公司，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白β1（recombinant human neuregulin beta-1，rh-NRG-β1）和血小板源性生長(zhǎng)因子AA（platelet-derived growth factor-AA， PDGF-AA） 購(gòu) 于 美 國(guó)PeproTech公司，兔抗S100抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗NGF抗體、兔抗NeuN抗體、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG熒光二抗、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG均購(gòu)于美國(guó)Abclonal公司，BCA蛋白定量試劑盒、RIPA蛋白裂解液和小鼠抗β-actin抗體均購(gòu)于沈陽(yáng)鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，抗熒光淬滅封片液、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液和DAB染色液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司。BX43熒光顯微鏡、CKX53倒置顯微鏡及其相應(yīng)圖像采集系統(tǒng)均購(gòu)于日本Olympus公司。

1.2 原代ADSCs的分離培養(yǎng)及其分化能力檢測(cè)采用2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg－1）腹腔注射麻醉大鼠，無(wú)菌條件下分離獲取雙側(cè)附睪旁的脂肪組織，充分清洗并剪碎。采用0.1%Ⅰ型膠原酶對(duì)獲取組織消化45～60 min，后加入含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，置于200鉬濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾和離心（1 000 r·min－1，10 min），得到細(xì)胞沉淀。向沉淀中加入適量含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液，接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)情況。48 h后第1次換液，然后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每2～3 d換液1次。當(dāng)貼壁細(xì)胞爬滿瓶底80%左右時(shí)，采用0.25%胰酶-EDTA消化，按1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選取第3代ADSCs，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105mL－1，接種于帶有無(wú)菌蓋玻片的6孔板上，置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合時(shí)，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.1μmol·L－1地塞米松、50μmol·L－1維生素C和10 mmol·L－1β-甘油磷酸鈉），25～28 d后進(jìn)行茜素紅染色，檢測(cè)ADSCs的成骨誘導(dǎo)分化能力。

1.3 ADSCs向SCs誘導(dǎo)分化及其鑒定選取第3代ADSCs，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，采用0.25%胰酶-EDTA消化后收集細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105mL－1，接種于25 mL培養(yǎng)瓶中。首先進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)：采用含1 mmol·L－1β-ME無(wú)血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，含35μg·L－1ATRA的培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h。隨后更換為含血清、14μmol·L－1FSK、5μg·L－1PDGF-AA、200μg·L－1rh-HRG-β1和10μg·L－1bFGF的SCs條件培養(yǎng)液培養(yǎng)進(jìn)行正式誘導(dǎo)，時(shí)間為10～14 d。以基礎(chǔ)培養(yǎng)液作為對(duì)照組，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。在細(xì)胞爬片24～48 h后，采用含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液固定細(xì)胞20～30 min。5%血清封閉30 min，加入兔抗S100抗體（1∶200），置于4℃冰箱孵育過(guò)夜。第2天，室溫平衡1 h后，加入Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶200），37℃避光孵育1 h，0.01 mol·L－1PBS漂洗3次，每次5 min，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光防淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行圖像采集。

1.4 原代DRG細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定選取出生后1～3 d的幼鼠，采用75%酒精進(jìn)行浸泡消毒，取出DRG，采用眼科剪將其充分剪碎，加入2倍體積的0.25%胰酶-EDTA于37℃恒溫箱內(nèi)消化30～40 min。加入等量的含血清的培養(yǎng)基終止消化、1 000 r·min－1離心5 min，棄去上清后再加入適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，200鉬濾網(wǎng)過(guò)濾，行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106mL－1，接種于培養(yǎng)瓶中并置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。常規(guī)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液、傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察DRG細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。取第3代DRG細(xì)胞爬片，免疫組織化學(xué)染色觀察DRG細(xì)胞中NeuN蛋白的表達(dá)情況。

1.5 共培養(yǎng)體系的建立和細(xì)胞分組采用直接接觸式共培養(yǎng)的方法建立SCLCs與DRG細(xì)胞共培養(yǎng)體系。取第3代DRG細(xì)胞和SCLCs，在細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)，采用0.25%胰酶-EDTA消化后收集細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105mL－1，隨后將兩者以相同體積混合為共培養(yǎng)組。單培養(yǎng)組則是將2份等體積的DRG細(xì)胞直接混合后進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。2組細(xì)胞均根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行接種和鋪板，置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行細(xì)胞染色和蛋白提取。

1.6 HE染色觀察DRG細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)采用含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液對(duì)細(xì)胞固定20～30 min。0.01 mol·L－1PBS洗 滌 細(xì) 胞3次，時(shí) 間 分 別 為10、5和5 min。先采用蘇木素染色10～15 min，自來(lái)水沖洗15 min，再采用伊紅染色6 min，采用鹽酸-酒精分化30 s，自來(lái)水沖洗5 min。分別采用70%、80%、90%、95%和100%酒精進(jìn)行脫水。二甲苯透明，最后中性樹膠封片、光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察和圖像采集。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野下細(xì)胞數(shù)目。每組隨機(jī)選取3張切片，每張切片任選3個(gè)視野，取平均值。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DRG細(xì)胞中神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN）和NGF蛋白表達(dá)情況細(xì)胞爬片24～48 h后，采用含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液固定細(xì)胞20～30 min。0.01 mol·L－1PBS洗滌細(xì)胞3次，時(shí)間分別為10、5和5 min。采用3%Triton X-100處理10 min，0.01 mol·L－1PBS洗滌3次，每次5 min。山羊血清IgG封閉30 min，滴加一抗兔抗NeuN（1∶200）和兔抗NGF（1∶200），置于4℃冰箱孵育過(guò)夜。第2天，室溫平衡1 h后采用0.01 mol·L－1PBS洗滌3次，時(shí)間分別為10、5和5 min，加入山羊抗兔IgG，37℃孵育2 h，0.01 mol·L－1PBS洗 滌3次，每 次5 min。DAB顯色3～10 min，蘇木素染色15 min后流水沖洗15 min（NeuN不需要蘇木素復(fù)染），經(jīng)過(guò)70%、80%、90%、95%和100%酒精進(jìn)行脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并進(jìn)行圖像采集。

1.8 Western blotting法檢測(cè)2組DRG細(xì)胞中NGF蛋白表達(dá)水平當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約80%融合時(shí)，采用0.25%胰酶-EDTA消化后收集細(xì)胞得到沉淀，加入裂解液置于冰上裂解30～40 min，提前將離心機(jī)溫度設(shè)置為4℃、12 000 r·min－1離 心30 min，其上清為所提取細(xì)胞的蛋白。采用BCA蛋白試劑盒進(jìn)行定量、凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，采用5%FBS于室溫下封閉1 h，加入一抗分別為兔抗NGF（1∶400）和小鼠抗β-actin（1∶5 000），置于4℃冰箱孵育過(guò)夜。第2天，室溫平衡1 h后采用TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min，依次加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG（1∶10 000），37℃孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，ECL發(fā)光后檢測(cè)蛋白條帶，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。共培養(yǎng)組和單培養(yǎng)組DRG細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞突起數(shù)和DRG細(xì)胞中NGF蛋白表達(dá)水平均呈正態(tài)分布，以±s表示，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs的形態(tài)表現(xiàn)和分化能力原代培養(yǎng)48 h，鏡下可見散在、單一和兩端略長(zhǎng)的短梭型細(xì)胞，胞體周圍有亮?xí)灒▓D1A）。7 d以后，細(xì)胞數(shù)量增加、體積增大、胞體伸展呈長(zhǎng)梭形或樹葉狀，細(xì)胞排列緊簇，呈旋渦狀或類似鋪路石樣外觀（圖1B）。為檢測(cè)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是否為ADSCs，對(duì)其進(jìn)行分化能力的檢測(cè)。細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)25～28 d后行茜素紅染色，顯微鏡下可觀察到鈣化的結(jié)節(jié)（圖1C）。

圖1 ADSCs的形態(tài)表現(xiàn)和分化能力（×200）Fig.1 Morphology and differentiation ability of ADSCs（×200）

2.2 ADSCs誘導(dǎo)分化SCLCs的形態(tài)表現(xiàn)和鑒定第3代ADSCs通過(guò)β-ME和ATRA的預(yù)誘導(dǎo)及FSK、PDGF-AA、rh-HRG-β1和bFGF的正式誘導(dǎo)，其向SCs誘導(dǎo)分化。初期，鏡下可見細(xì)胞體明亮呈梭形，胞體兩端伸出細(xì)長(zhǎng)的突起。7～8 d后，細(xì)胞體積明顯增加，胞體變?yōu)閳A形或橢圓形，折光度進(jìn)一步加強(qiáng)，突起變得更加細(xì)長(zhǎng)，形似樹枝或柵欄狀，形態(tài)多不規(guī)則，突起間相互形成連接形似網(wǎng)狀。為檢測(cè)所獲得的細(xì)胞是否為SCLCs，采用免疫熒光染色檢測(cè)SCs標(biāo)志物S100蛋白的表達(dá)。熒光顯微鏡下可見S100蛋白被標(biāo)記為紅色熒光，陽(yáng)性產(chǎn)物主要集中在胞漿及其突起，DAPI浸染細(xì) 胞核，為藍(lán)色熒光。見圖2。

圖2 SCLCs的形態(tài)表現(xiàn)和鑒定（×200）Fig.2 Morphology and identification of SCLCs（×200）

2.3 DRG細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)和Neu N蛋白免疫組織化學(xué)染色情況原代培養(yǎng)DRG細(xì)胞24 h，倒置顯微鏡下可見部分細(xì)胞已貼壁，DRG細(xì)胞數(shù)較多、成纖維細(xì)胞較少，并且DRG細(xì)胞胞體周圍可見光環(huán)，成纖維細(xì)胞無(wú)此現(xiàn)象（圖3A）。48 h后DRG細(xì)胞胞體變大，突起變長(zhǎng)，排列不規(guī)則（圖3B）。培養(yǎng)72 h后DRG細(xì)胞突起變得細(xì)而長(zhǎng)，且細(xì)胞突起之間形成連接，呈花環(huán)樣排列（圖3C）。7～8 d時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，胞體較大，呈圓形，突起細(xì)長(zhǎng)，類似樹枝狀伸出，細(xì)胞突起之間相互連接更為緊密，似柵欄樣（圖3D）。NeuN是成熟神經(jīng)細(xì)胞特異性的標(biāo)志物，本研究采用免疫組織化學(xué)染色對(duì)獲得細(xì)胞進(jìn)行NeuN染色，結(jié)果顯示幾乎所有細(xì)胞核均被標(biāo)記為棕褐色（圖3E～3G）。

圖3 DRG細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)和Neu N蛋白免疫組織化學(xué)染色情況Fig.3 Morphology of DRG cells and immunohistochemical staining of NeuN protein in DRG cells

2.4 2組DRG細(xì)胞數(shù)和DRG細(xì)胞突起數(shù)單培養(yǎng)組平均每個(gè)視野下可見（20.220±3.962）個(gè)細(xì)胞，共培養(yǎng)組平均每個(gè)視野下可見（105.600±10.550）個(gè)細(xì)胞，共培養(yǎng)組DRG細(xì)胞數(shù)明顯多于單培養(yǎng)組（P＜0.05）；高倍鏡下觀察結(jié)果顯示：共培養(yǎng)組DRG細(xì)胞突起數(shù)（3.200個(gè)±0.374個(gè)）明顯多于單培養(yǎng)組（1.800個(gè)±0.200個(gè)）（P＜0.05），而且突起呈細(xì)長(zhǎng)狀，彼此之間相互連接，形似花環(huán)狀排列。見圖4。

圖4 HE染色觀察2組DRG細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)Fig.4 Morphology of DRG cells in two groups observed by HE staining

2.5 2組DRG細(xì)胞中NGF蛋白表達(dá)水平免疫組織化學(xué)檢測(cè)可見NGF蛋白免疫陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞質(zhì)，為棕褐色產(chǎn)物，細(xì)胞核不著色，見圖5。Western blotting法半定量分析結(jié)果顯示：?jiǎn)闻囵B(yǎng)組和共培養(yǎng)組DRG細(xì)胞中NGF蛋白表達(dá)水平分別為（0.193 3±0.010 6）和（0.716 5±0.003 9）。與單培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)組DRG細(xì)胞中NGF蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），見圖6。

圖5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)2組DRG細(xì)胞中NGF蛋白表達(dá)情況（×200）Fig.5 Expressions of NGF protein in DRG cells in two groups detected by immunohistochemical staining（×200）

圖6 Western blotting法檢測(cè)2組DRG細(xì)胞中NGF蛋白表達(dá)電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of NGF protein in DRG cells in two groups detected by Western blotting method

3 討 論

神經(jīng)纖維離斷會(huì)導(dǎo)致與之相連的神經(jīng)元胞體損傷，進(jìn)而發(fā)生崩解和破壞等一系列反應(yīng)，稱之為潰變。DRG細(xì)胞作為初級(jí)感覺神經(jīng)元，是連接外周神經(jīng)纖維與中樞的中繼站。研究［12］顯示：PNI可導(dǎo)致DRG細(xì)胞胞體腫脹、胞核偏位或者移位、細(xì)胞數(shù)減少，進(jìn)而使神經(jīng)細(xì)胞之間的連接發(fā)生紊亂，引起感覺功能障礙。因此，探討促進(jìn)DRG細(xì)胞生長(zhǎng)的因素在PNI后再生修復(fù)中意義重大。本研究采用直接接觸式共培養(yǎng)的方法建立SCLCs與DRG細(xì)胞共培養(yǎng)體系。本研究結(jié)果顯示：在共培養(yǎng)條件下，DRG細(xì)胞數(shù)及其突起數(shù)明顯增加，說(shuō)明SCLCs促進(jìn)了DRG細(xì)胞的生長(zhǎng)，這對(duì)周圍神經(jīng)損傷后的感覺功能恢復(fù)具有極大的促進(jìn)作用。楊雨潔等［13］研究顯示：腹腔注射嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)上清液，可增加大鼠DRG細(xì)胞神經(jīng)軸突數(shù)并提高髓鞘化能力，進(jìn)而促進(jìn)坐骨神經(jīng)的再生。李文輝等［14］觀察到內(nèi)皮祖細(xì)胞可增加DRG細(xì)胞突起數(shù)、最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度及平均突起長(zhǎng)度，下調(diào)Nogo-A和NgR的表達(dá)，促進(jìn)DRG細(xì)胞突起生長(zhǎng)。本研究所采用的SCLCs是ADSCs在多因子的聯(lián)合誘導(dǎo)下分化獲得，其不僅具有ADSCs所具備的來(lái)源廣泛、取材簡(jiǎn)單和增殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，還能充分發(fā)揮SCs促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)再生的作用，如可通過(guò)趨化作用引導(dǎo)生長(zhǎng)錐生長(zhǎng)和通過(guò)分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為神經(jīng)再生創(chuàng)造微環(huán)境等［15］。研究［7］顯示：SCLCs可增加坐骨神經(jīng)損傷大鼠脊髓內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和NGF蛋白的表達(dá)，抑制JAK2/STAT 3信號(hào)通路的活化，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)損傷神經(jīng)再生的作用。任旺等［16］研究顯示：SCLCs可增加DRG細(xì)胞數(shù)及其突起數(shù)和長(zhǎng)度，提高細(xì)胞中BDNF蛋白的表達(dá)。

NGF兼有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)生長(zhǎng)因子的雙重作用，在周圍神經(jīng)的損傷修復(fù)中具有促進(jìn)SCs增殖、引導(dǎo)軸突定向生長(zhǎng)和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用［17-18］。LI等［19］研究結(jié)果顯示：NGF可通過(guò)激活SCs自噬，增強(qiáng)清除髓鞘碎片的能力，起到加速早期神經(jīng)再生的作用。LIAO等［20］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：填充NGF硅橡膠管的實(shí)驗(yàn)組其神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯升高，潛伏期明顯縮短，神經(jīng)再生的組織形態(tài)學(xué)均優(yōu)于對(duì)照組。SANG等［21］在坐骨神經(jīng)損傷模型研究中發(fā)現(xiàn)：姜黃素可刺激NGF的釋放，NGF可進(jìn)一步激活Trk A和PI3K/Akt細(xì)胞存活信號(hào)通路，發(fā)揮對(duì)損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示：共培養(yǎng)組DRG細(xì)胞中NGF蛋白表達(dá)水平明顯高于單培養(yǎng)組。因NGF具有促進(jìn)感覺神經(jīng)元生長(zhǎng)和存活的功能，因此推測(cè)SCLCs促進(jìn)DRG細(xì)胞生長(zhǎng)的作用可能與共培養(yǎng)組DRG細(xì)胞中增加的NGF蛋白有關(guān)。有研究［22］顯示：NGF還可以促進(jìn)SCs的分裂增殖，SCs則會(huì)進(jìn)一步分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，從而形成促進(jìn)神經(jīng)再生的正反饋環(huán)路。另一方面，NGF可減少DRG細(xì)胞體腫脹和胞核移位或偏位等保護(hù)DRG細(xì)胞不受或少受損傷，使其維持在正常的功能狀態(tài)，有利于DRG細(xì)胞的生長(zhǎng)。本課題組前期研究結(jié)果還證實(shí)：SCLCs可增加DRG細(xì)胞中BDNF蛋白的表達(dá)，但表達(dá)升高的NGF和BDNF是否來(lái)自于SCLCs及兩者通過(guò)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制促進(jìn)DRG細(xì)胞增殖的尚需進(jìn)一步研究。