曹秋婷,韓競春,張曉飛

（大連大學附屬新華醫(yī)院腫瘤一科，遼寧 大連 116021）

伊立替康（irinotecan）又稱CPT-11，是臨床治療轉移性結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的一、二線化療藥物，但其耐藥性的產(chǎn)生導致部分患者治療失敗，而這一現(xiàn)象嚴重限制了CPT-11的臨床應用，并給CRC患者帶了巨大的健康和經(jīng)濟負擔［1-2］。研究［3-4］顯示：耐藥性的產(chǎn)生可能與腫瘤相關基因的異常表達相關。近期研究［5-7］證實：布盧姆綜合征解旋酶（Bloom’s syndrome helicase，BLM）高表達于包括CRC在內(nèi)的多種腫瘤組織中，且與腫瘤的發(fā)生進展密切相關。針對膀胱癌耐藥性的研究［8-9］顯示：沉默或下調(diào)BLM能明顯改善腫瘤細胞的化療敏感性。而這可能與BLM在細胞中的功能相關，如基因分子功能研究［10］顯示：BLM主要參與DNA損傷反應中的缺陷、斷裂和重組等過程，并能維持基因組與染色體的穩(wěn)定。但在CRC患者中，尚不明確CPT-11耐藥性產(chǎn)生的相關機制是否與BLM異常表達有關。本研究篩選高表達BLM的CRC RKO和DLD1細胞，探討改善CRC患者臨床預后的新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、實驗動物、主要試劑和儀器人CRC細胞系HT-29、Lovo、HCT-116、RKO和DLD1購自美國模式培養(yǎng)物研究所（American Type Culture Collection，ATCC）。6周齡雄性BALB/c裸鼠購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2018-0003。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和1%青-鏈霉素混合液（美國Hyclone公司），TUNEL試劑盒（瑞士Roche公司），SYBR Green PCR master mix試劑盒和PrimeScript RT反轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司），CCK-8試劑和CPT-11（美國Sigma公司），DAB顯色試劑盒（南京建成生物科技有限公司），Ki-67細胞增殖檢測試劑盒（美國Thermo公司），BCA蛋白測定試劑盒和RIPA試劑（美國Pierce公司），兔抗BLM和細胞周期素D1（Cyclin D1）、B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（美國Cell Signaling Technology公司），AnnevinⅤ-FITC/PI試劑盒（美國BD公司），PI細胞周期檢測試劑盒和HRP標記的山羊抗兔二抗（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗Bcl-2關聯(lián)死亡啟動子（Bcl-2 associated death promoter，Bad）、裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase-3）、周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent protein kinase 4，CDK4）、周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent protein kinase 6，CDK 6）、細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A （cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，p21）和β-actin（美國Abcam公司），攜帶沉默BLM 的 shRNA （5′-GAAACTAGTCTCGGCACTTCT-3′）及 陰 性 對 照 序 列shRNA（5′-CAACAAGATGAAGAGCACCAA-3′）的 重 組 慢病毒顆粒載體（LV-shBLM與LV-shNC）由上海漢恒生物科技有限公司設計和包裝（慢病毒滴度為5×107TU·μL－1），實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）引物由上海生工合成。FACSCalibur?流式細胞儀（美國BD Biosciences），超凈工作臺（美國Thermo公司），RT-PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)和慢病毒感染采用含10%FBS、1%青-鏈霉素和2 mmol·L－1谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)CRC HT-29、Lovo、HCT-116、RKO及DLD1細胞。所有細胞均置于含5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的RKO和DLD1細胞，按每孔2×105個細胞接種至24孔板中，培養(yǎng)過夜后，按感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=20進行感染細胞，同時加入5 mg·L－1聚凝胺以提高感染效率，在含5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，棄去含病毒的培養(yǎng)液，更換為含10%FBS和2 mmol·L－1L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用熒光顯微鏡觀察慢病毒感染細胞中綠色熒光表達。最后加入2 mg·L－1嘌呤霉素篩選7 d，以獲得穩(wěn)定感染的RKO和DLD1細胞。

1.3 CCK-8法檢測各組細胞存活率取感染LVshBLM（LV-shBLM組）與LV-shNC（LV-shNC組）的RKO和DLD1細胞，調(diào)整密度后，按每孔2×104個細胞的密度接種至96孔板中，并采用200μL含不同濃度（0、0.1、1.0、10.0、100.0、200.0和400.0μmol·L－1）CPT-11的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，每孔加入10μL CCK-8試劑，繼續(xù)置于含5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，采用酶標儀于450 nm波長處測定每孔吸光度（A）值。將0μmol·L－1CPT-11設為對照組，計算各組細胞存活率，并繪制曲線，分析CPT-11對各組RKO和DLD1細胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值。細胞存活率=（實驗組A值－空白組A值）/（對照組A值－空白組A值）×100%。每組每個濃度設置6個復孔，實驗單獨重復3次。

1.4 細胞處理和分組根據(jù)CCK-8法檢測的CPT-11對RKO和DLD1細胞的IC50值，分別將RKO和DLD1細胞分為LV-shNC組、CPT-11+LV-shNC組和CPT-11+LV-shBLM組。將各組細胞置于含5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗檢測。

1.5 RT-qPCR法檢測各組CRC細胞中BLM mRNA表達水平TRIzol法提取HT-29、Lovo、HCT-116、RKO和DLD1細胞及慢病毒感染后的RKO和DLD1細胞中總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書方法將其逆轉錄為cDNA，取適量cDNA根據(jù)SYBR green RT-PCR試劑盒建議的反應體系和條件進行RT-PCR，反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。RT-PCR引物序列：BLM-F 5′-ACAGTAAATGCCTGATGGACCT-3′，BLM-R 5′-ATTGGGTATGTGAATGCTGGT-3′； β-actin-F 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，β-actin-R 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。以β-actin作為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算BLM mRNA表達水平。實驗單獨重復3次。

1.6 流式細胞術檢測不同細胞周期各組細胞百分率取各組RKO和DLD1細胞，常規(guī)消化后，取約2×105個細胞，預冷PBS洗滌后，1 500 r·min－1離心5 min，取底層細胞沉淀，加入3.5 mL預冷的70%乙醇溶液，充分混勻并置于4℃固定過夜，再次離心后，加入20μL（50 mg·L－1）RNase重懸細胞，37℃水浴消化30 min，隨后再加入20μL（50 mg·L－1）PI染色液，避光孵育30 min，200目濾膜過濾細胞團塊，最后上機分析不同細胞周期各組細胞百分率。實驗單獨重復3次。

1.7 Western blotting法檢測各組CRC細胞中BLM、Cyclin D1、CDK4、CDK6、p21、Bcl-2、Bax、Bad和cleaved caspase-3蛋白表達水平預冷PBS洗滌待測的HT-29、Lovo、HCT-116、RKO和DLD1細胞和經(jīng)慢病毒感染的RKO和DLD1細胞，總蛋白采用RIPA裂解液提取，采用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度，加熱變性后，取約30μg蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉移至PVDF膜上后，采用5%脫脂奶粉進行抗體封閉，TBST緩沖液充分洗膜后，依次加稀釋后的一抗：BLM（1∶500）、Bcl-2（1∶800）、Bax（1∶800）、Bad（1∶800）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、Cyclin D1（1∶800）、CDK 4（1∶800）、CDK 6（1∶800）、p21（1∶800）、β-actin（1∶2 000），置于4℃條件下?lián)u床孵育過夜，次日TBST緩沖液再次洗滌，再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000）于室溫下孵育1 h后，采用ECL試劑于凝膠成像系統(tǒng)中檢測蛋白條帶信號強度，采用Image J軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參對照，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。實驗單獨重復3次。

1.8 AnnexinⅤ-FITC/PI染色結合流式細胞術檢測各組細胞凋亡率收集各組RKO和DLD1細胞，按照AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒說明書進行染色。細胞收集后采用細胞凋亡試劑Buffer調(diào)整細胞密度，取約1×106個細胞置于流式管中，依次加入5μL AnnexinⅤ-FITC和5μL PI室溫下避光孵育15 min，隨后采用流式細胞術分析各組細胞凋亡率。細胞凋亡率=（早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù)）/細胞總數(shù)×100%。實驗單獨重復3次。

1.9 裸鼠皮下移植瘤模型制備15只裸鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房中，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為LV-shNC組、CPT-11+LV-shNC組和CPT-11+LV-shBLM組，每組5只。于各組小鼠左側腋窩皮下注射約含5×106mL－1感染LV-shNC或LVshBLM的DLD1細胞懸液200μL，其中按參考文獻［11］的方法對CPT-11+LV-shNC組和CPT-11+LV-shBLM組小鼠隔天經(jīng)腹腔注射溶于生理鹽水的CPT-11（4 mg·kg－1），LV-shNC組小鼠同頻次注射等體積的生理鹽水。每3 d測量腫瘤的長度和寬度，腫瘤體積=（長度×寬度2）/2，監(jiān)測接種42 d內(nèi)的腫瘤體積變化。42 d后處死各組小鼠，取腫瘤組織進行免疫組織化學染色，觀察腫瘤組織中BLM和Ki-67陽性表達率，TUNEL染色檢測細胞凋亡率。本研究的動物實驗經(jīng)過本院倫理委員會批準，相關實驗操作符合國際動物研究指導原則。

1.10 移植瘤組織的免疫組織化學染色和TUNEL染色免疫組織化學染色：取各組裸鼠的移植瘤組織，于4%甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋并切片至厚度約為4μm，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，切片經(jīng)微波加熱進行抗原修復，以3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌后，山羊血清進行抗體封閉，隨后加入兔抗小鼠BLM（1∶300）與Ki-67（1∶500）一抗，4℃條件下孵育過夜，次日充分洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶1 000），再加入DAB試劑顯色5 min，自來水沖洗后，蘇木精復染，再次脫水透化，封片進行顯微鏡觀察。其中細胞核為藍色，BLM和Ki-67陽性表達為棕黃色或黃褐色，BLM或Ki-67陽性表達率=BLM或Ki-67陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。TUNEL染色：按前述方法進行固定，石蠟包埋，切片，脫蠟水化等步驟后按照TUNEL試劑盒說明書進行染色，37℃下避光孵育1 h，DAB顯影與蘇木精復染后，顯微鏡下觀察拍照。每個切片隨機選擇10個視野進行分析，計算TUNEL陽性表達率。其中TUNEL陽性染色的細胞核為棕黃色，TUNEL陽性表達率=TUNEL陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.11 統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。CRC細胞中BLM mRNA和蛋白表達水平，各組CRC細胞存活率，不同細胞周期細胞百分率，細胞凋亡率和細胞中Cyclin D1、CDK4、CDK6、p21、Bcl-2、Bax、Bad和cleaved caspase-3表達水平及各組裸鼠皮下移植瘤體積均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗。各組裸鼠腫瘤組織中BLM、Ki-67和TUNEL陽性表達率以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 BLM在CRC細胞中的表達RT-PCR和Western blotting檢測結果顯示：BLM mRNA和蛋白在HT-29、Lovo、HCT-116、RKO和DLD1細胞中均有表達，與HT-29、Lovo和HCT-116細胞比較，RKO和DLD1細胞中BLM mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.05）。因此，選擇RKO和DLD1細胞進行后續(xù)相關實驗。見圖1。

圖1 RT-PCR和Western blotting法檢測各種細胞中BLM mRNA和蛋白表達水平Fig.1 Expression levels of BLM mRNA and protein in different kinds of cells detected by RT-PCR and Western blotting methods

2.2 熒光顯微鏡下慢病毒感染CRC細胞的效率熒光顯微鏡觀察結果表明：感染LV-shNC和LVshBLM的RKO和DLD1細胞中均可見綠色熒光表達，細胞感染效率可達80%以上。見圖2。RT-qPCR檢測結果顯示：與感染LV-shNC的RKO（1.00±0.08）或DLD1（1.00±0.11）細胞比較，感染LV-shBL的MRKO（0.24±0.09）和DLD1細胞（0.11±0.03）中BLM mRNA表達水平明顯降低（P＜0.01）。

圖2 熒光顯微鏡觀察慢病毒感染的RKO和DLD1細胞形態(tài)表現(xiàn)（×200）Fig.2 Morphology of RKO and DLD1 cells infected with lentivirus observed under fluorescence microscope（×200）

2.3 各組RKO和DLD1細胞存活率CCK-8細胞實驗檢測結果顯示：與感染LV-shNC的RKO或DLD1細胞比較，CPT-11作用后，感染LVshBLM的RKO或DLD1細胞存活率降低，且與LV-shNC組RKO［（71.24±13.11）μmol·L－1］或DLD1［（68.09±15.73）μmol·L－1］細 胞 比較，CPT-11對LV-shBLM組RKO［（21.44±7.40）μmol·L－1］或DLD1細 胞［（17.61±12.14）μmol·L－1］的IC50值明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 CCK-8法檢測2組RKO(A)和DLD1(B)細胞存活率Fig.3 Survival rates of RKO(A)and DLD1(B)cells in two groups detected by CCK-8 assay

2.4 不同細胞周期各組CRC細胞百分率與LVshNC組比較，CPT-11+LV-shNC與CPT-11+LV-shBLM組G0/G1期和S期RKO或DLD1細胞百分率明顯升高（P＜0.05），而G2/M期細胞百分率明顯降低（P＜0.05），其中CPT-11+LV-shBLM組G0/G1期和S期細胞百分率較CPT-11+LVshNC組明顯升高（P＜0.05），而G2/M期細胞百分率明顯降低（P＜0.05），見圖4和5。

圖4 流式細胞術檢測不同細胞周期各組CRC細胞百分率Fig.4 Percentages of CRC cells at different cell cycles in various groups detected by flow cytometry

2.5 各組細胞中細胞周期相關蛋白表達水平Western blotting法檢測細胞周期相關蛋白表達水平結果顯示：與LV-shNC組比較，CPT-11+LV-shNC和CPT-11+LV-shBLM組RKO和DLD1細胞中Cyclin D1、CDK 4及CDK 6蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），而細胞周期抑制蛋白p21表達水平明顯降低（P＜0.05）；與CPT-11+LV-shNC組比較，CPT-11+LV-shBLM組上述細胞周期相關蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 Western blotting法檢測各組細胞中細胞周期相關蛋白表達水平Fig.6 Expression levels of cell cycle-related proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

2.6 各組CRC細胞凋亡率與LV-shNC組比較，CPT-11+LV-shNC和CPT-11+LV-shBLM組RKO或DLD1細胞凋亡率均升高（P＜0.05），且CPT-11+LV-shBLM組RKO或DLD1細胞凋亡率較CPT-11+LV-shNC組 升 高（P＜0.05）。見圖7和8。

圖7 流式細胞術檢測各組RKO細胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of RKO cells in various groups detected by flow cytometry

2.7 各組細胞中BLM和凋亡相關蛋白表達水平Western blotting法檢測結果顯示：與LVshNC組比較，CPT-11+LV-shNC和CPT-11+LV-shBLM組RKO或DLD1細胞中BLM蛋白及抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低（P＜0.05），而促凋亡蛋白Bax、Bad和cleaved caspase-3表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與CPT-11+LV-shNC組比較，CPT-11+LV-shBLM組RKO或DLD1細胞中BLM蛋白及抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低（P＜0.05），而促凋亡蛋白Bax、Bad和cleaved caspase-3表達水平升高（P＜0.05）。見圖9。

圖5 不同細胞周期各組CRC細胞百分率Fig.5 Percentages of CRC cells at different cell cycles in various groups

圖9 Western blotting法檢測各組細胞中BLM和凋亡相關蛋白表達電泳圖(A)和直條圖(B,C)Fig.9 Electrophoregram(A)and histogram(B,C)of expressions of BLM and apoptosis-related proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

2.8 各組裸鼠皮下移植體積和腫瘤組織中BLM、Ki-67及TUNEL陽性表達率與LV-shNC組比較，CPT-11+LV-shNC組和CPT-11+LV-shBLM組裸鼠腫瘤體積明顯降低（P＜0.05），而CPT-11+LV-shBLM組裸鼠腫瘤體積較CPT-11+LVshNC組降低（P＜0.05），見圖10和11。腫瘤組織中BLM、Ki-67和TUNEL染色結果顯示：LVshNC組腫瘤組織中BLM、Ki67和TUNEL陽性表達率分別為73.12%、52.06%和33.11%，CPT-11+LV-shNC組腫瘤組織中BLM、Ki-67和TUNEL陽性表達率為48.14%、37.19%和49.05%，CPT-11+LV-shBLM組腫瘤組織中BLM、Ki-67和TUNEL陽性表達率為25.51%、13.47%及72.36%。與LV-shNC組比較，CPT-11+LV-shNC組和CPT-11+LV-shBLM組腫瘤組織中BLM及Ki-67陽性表達率明顯降低（P＜0.05），TUNEL陽性表達率明顯升高（P＜0.05）。見圖12。

圖8 流式細胞術檢測各組DLD1細胞凋亡率Fig.8 Apoptotic rates of DLD1 cells in various groups detected by flow cytometry

圖10 各組裸鼠皮下移植瘤形態(tài)表現(xiàn)Fig.10 Morphology of subcutaneous transplanted tumor of nude mice in various groups

圖12 免疫組織化學染色觀察各組裸鼠腫瘤組織中BLM、Ki-67和TUNEL的表達(Bar=25μm)Fig.12 Expressions of BLM,Ki-67，and TUNEL in tumor tissue of nude mice in various groups detected by immunohistochemical staining(Bar=25μm)

3 討 論

圖11 各組裸鼠皮下移植瘤體積Fig.11 Volumes of subcutaneous transplanted tumor of nude mice in various groups

CRC是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，而腫瘤細胞對化療藥物表現(xiàn)出內(nèi)在的耐藥性是導致CRC死亡率居高不下的重要原因［3-4，12］。屬于喜樹堿類衍生物的CPT-11是近年來治療轉移性CRC的主要化療藥物，但由于CRC細胞對其化療不敏感性的廣泛存在，導致其臨床應用療效不理想。藥理作用機制研究［13-15］顯示：喜樹堿及其衍生物主要通過抑制拓撲異構酶Ⅰ的作用，能快速而有效地改變DNA的結構，阻滯其再連接過程，從而促使DNA損傷，破壞其復制，最終誘導細胞發(fā)生凋亡。因此，腫瘤細胞中DNA損傷修復作用嚴重影響抗癌治療。本研究結果顯示：在體內(nèi)外沉默CRC細胞中BLM表達可通過抑制腫瘤細胞的周期進展，從而促進化療藥物CPT-11誘導的細胞凋亡，而這可能與沉默BLM表達可阻滯CRC細胞中DNA損傷修復有關。

BLM屬于RecQ家族，后者是細胞中一類重要的DNA解旋酶，該家族主要利用ATP水解所產(chǎn)生的能量進行分解DNA雙鏈分子，從而糾正并修復錯配的堿基對以降低自身或外界環(huán)境中誘導DNA損傷［16-17］。既往研究［5］顯示：BLM在多種腫瘤組織或細胞呈異常高表達現(xiàn)象。研究［18-19］顯示：在肺癌、胃癌、鼻咽癌和卵巢癌等細胞中，BLM mRNA和蛋白表達水平均明顯高于正常細胞，推測BLM可能作為上述腫瘤治療的潛在特異性分子靶標。QIAN等［20］在前列腺癌中研究表明：BLM在前列腺癌組織和細胞中的表達明顯高于正常組織和前列腺增生的細胞，同時，shRNA敲除BLM可抑制前列腺癌細胞的增殖，促進其凋亡。VOTINO等［7］通過對CRC公開數(shù)據(jù)庫的全基因組分析發(fā)現(xiàn)：BLM在CRC組織中過表達，且與腫瘤的低分化和較短的生存期密切相關。此外，在化療耐藥性的研究領域中，馮大林等［8］和吳萍等［9］在前列腺癌細胞對順鉑及絲裂霉素C化療敏感性的相關研究中發(fā)現(xiàn)：BLM基因低表達的前列腺癌細胞對上述化療藥物更敏感，而利用shRNA敲除其表達能明顯降低腫瘤細胞的化療抵抗。本研究結果表明：沉默或敲除CRC中BLM表達能明顯提高細胞對CPT-11的化療敏感性；同時，結合CPT-11與BLM相關作用進一步對上述現(xiàn)象的分子機制研究表明：沉默BLM可能通過抑制促細胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4和CDK 6的表達而上調(diào)周期阻滯相關蛋白p21的表達，從而促使CRC細胞出現(xiàn)DNA合成前期的G1期和合成期的S期阻滯，而分布于DNA合成后期的G2期細胞百分率明顯降低。這種現(xiàn)象與細胞周期活動中DNA的合成過程相關。

眾所周知，細胞的周期活動可分為間期與分裂期，而間期又可具體分為DNA合成前期（即G0/G1期）、DNA復制合成期（即S期）和即將進入分裂期的合成后期（G2/M期）［21-23］。BLM主要參與DNA的修復，故沉默其表達能通過加劇CPT-11誘導的DNA損傷，抑制DNA的合成過程，從而阻礙CRC細胞進入分裂期。凋亡相關實驗也同樣顯示：沉默BLM表達能明顯促進CPT-11誘導的CRC細胞中凋亡相關蛋白Bax、Bad和cleaved caspase-3的表達，而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。本課題組還在裸鼠中對上述細胞實驗的相關結論進行了體內(nèi)檢測，結果同樣表明：沉默CRC細胞中BLM表達能促進CPT-11的化療敏感性。

綜上所述，沉默CRC細胞中BLM表達可能通過抑制腫瘤細胞的細胞周期進展，從而促進化療藥物CPT-11誘導的細胞凋亡，最終在體內(nèi)外改善腫瘤細胞的化療抵抗。但本課題組僅在實驗室階段對上述方面進行了初步探討，對于CRC細胞的其他惡性表征（如侵襲和轉移性）以及臨床應用中的作用及其相關機制仍需進一步研究。