顏培玉,張愛臣,章 宏,李 楊,張萌萌,洛夢澤,潘 穎

（1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長春130033；2.吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學系，吉林 長春130021）

針對卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）患者，現(xiàn)有很多臨床治療方法，但利弊共存，各種療法雖能在不同程度上緩解患者的臨床癥狀和改善卵巢功能，但無法從本質(zhì)上解決POF問題，因此為化療性卵巢早衰（chemotherapyinduced premature ovarian failure，CIPOF）患者尋求一種安全有效恢復卵巢功能的方法尤為重要。近年來研究［1-2］顯示：組織器官損傷后會釋放多種生物活性因子，引導移植到患者體內(nèi)的外源干細胞向損傷部位遷移。干細胞能在一定程度上恢復卵巢的功能。目前經(jīng)過骨髓移植的一部分癌癥患者的卵巢功能和生育能力得到改善，甚至可以分娩出健康的后代［3］。此外，干細胞通過自分泌、旁分泌和遠程分泌可產(chǎn)生干擾素（interferon，INF）類因子、生長因子、白細胞介素（interleukin，IL）類因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等多種細胞因子［4-5］，有效地促進卵巢血管再生，激活早衰的卵巢并使其去分化，修復早衰的卵巢。FAZELI等［5］和HE等［6］將干細胞移植至CIPOF患者機體后，干細胞可以分化為卵母細胞，修復受損的卵巢，改善卵巢的功能，且不具有成瘤性。但胚胎干細胞獲取不易且涉及倫理爭議，其他成體干細胞雖來源豐富但容易發(fā)生免疫排斥反應。脂肪間充質(zhì)干細胞 （adipose derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）具有數(shù)量多、操作簡單、容易獲取、分化能力強和免疫調(diào)節(jié)性良好的特點［7-8］。因此，ADMSCs在治療POF方面具有很大的應用前景。本研究采用ADMSCs治療POF大鼠，探討ADMSCs對POF模型大鼠的治療作用及其機制，為研究ADMSCs治療POF提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器未交配的6～8周齡雌性SD大鼠（SPF級）30只，體質(zhì)量180～220 g，購自吉林省長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司。根據(jù)《吉林大學實驗動物倫理審查的基本原則》的規(guī)定進行飼養(yǎng)及實驗。順鉑（江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司），TBD標準胎牛血清（以色列Biological Industries公司），DMEM低糖培養(yǎng)液（美國Hyclone公司），細胞增殖-毒性檢測試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）（北京Biosharp公司），成骨細胞誘導試劑盒和成脂細胞誘導試劑盒（美國Cyagen公司），F(xiàn)ITC抗鼠CD44、FITC抗鼠CD90和FITC抗鼠CD45（美國BioLegend公司）。TD5A低速離心機（中國上海Aida公司），D3024R高速離心機（美國SCILOGEX公司），恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），GFM-800P倒置相差顯微鏡（中國上海光密儀器有限公司），Synergy H1多功能酶標儀（美國BioTek公司），NovoCyte流式細胞分析儀（美國Agilent公司）。

1.2 大鼠ADMSCs的分離和培養(yǎng)采用7%水合氯醛將6～8周齡雌性大鼠麻醉后頸椎脫臼法處死，在無菌操作臺中用眼科剪、組織鑷子鈍和銳性完整剔除包繞脂肪組織的血管及筋膜，分離出大鼠雙側(cè)腹股溝脂肪。采用大量PBS沖洗，將其放入小燒杯中充分剪碎成體積約為1 mm×1 mm×1 mm組織塊，轉(zhuǎn)移至離心管中并加入其體積2～3倍的Ⅰ型膠原酶，置于37℃恒溫水浴中震蕩消化60 min（期間至少反復混勻3次），直至脂肪組織呈乳糜狀，采用完全培養(yǎng)基終止消化，濾網(wǎng)過濾下層消化產(chǎn)物得到細胞懸液，按1 500 r·min－1離心8 min。去上清液，以完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，以1×106mL細胞數(shù)接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，搖勻后將細胞平鋪于培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后首次換液，除去未貼壁血細胞，之后每3 d全量換液1次。每日在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀況。當貼壁細胞長滿瓶底壁面積的80%～90%后按照1∶2傳代培養(yǎng)，以下所有實驗均選擇第4（P4）代細胞進行。

1.3 ADMSCs多向分化潛能鑒定以2×104cm－2的種植密度將細胞接種于6孔板，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合至80%～90%時，更換成骨細胞誘導培養(yǎng)基［9］和成脂誘導培養(yǎng)基［10-11］，1周更換2次培養(yǎng)基，將培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基的細胞作為空白對照；分別在誘導分化后的第0、1、4、7、14和21天拍照記錄細胞形態(tài)變化；誘導分化14 d后，采用4%多聚甲醛固定細胞；根據(jù)油紅O染色劑說明，對誘導成脂的細胞進行染色［12］，脂肪顆粒為橘紅色。于第21天按照茜素紅S染色劑說明，對誘導成骨的細胞進行5 min的染色［9］，鈣沉積處為紅色。

1.4 流式細胞術(shù)鑒定ADMSCs棄去原培養(yǎng)基，采用PBS沖洗，終止消化后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1 200 r·min－1離心5 min；棄去上清液，加入PBS配置成密度為1×106L－1的細胞懸液；將其分別放入4支離心管中，每支離心管各100μL，編號為1～4號；第1號離心管為陰性對照管，加入等量相應的同型對照抗體。向2～4號離心管依次加入0.5μL FITC抗鼠CD44、0.1μL FITC抗鼠CD90和0.5μL FITC抗鼠CD45；避光冰上孵化30 min，1 200 r·min－1離心5 min，去上清液；采用PBS重懸，再次離心，去上清液；重復洗滌2次，再采用PBS重懸，等待上機。采用NovoCyte流式細胞分析儀進行分析。

1.5 ADMSCs生長曲線繪制采用胰蛋白酶-EDTA消化細胞后計數(shù)，將細胞配成不同密度的細胞懸液；接種于7塊96孔培養(yǎng)板中，分別設(shè)置每孔0、500、1 000和2 000個細胞，每組各5復孔，孔中加入完全培養(yǎng)基200μL，置于標準環(huán)境下培養(yǎng)；24 h后，取出其中1塊板，向其中所有孔中加入含有CCK-8溶液的工作液（600μL CCK-8與5 400μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基的混合溶液）100μL，混勻置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h；將96孔板置于酶標儀中，于450 nm波長處測量每孔吸光度（A）值；每天重復上述步驟1次，共操作7 d；繪制細胞生長曲線。

1.6 POF大鼠模型制備將30只6～8周齡和體質(zhì)量為180～220 g的SD大鼠分為正常對照組和造模組：正常對照組10只，造模組20只。造模組：每天上午8時以1.5 mg·kg－1的劑量腹腔注射順鉑，持續(xù)注射2周；正常對照組：每天上午8時腹腔注射生理鹽水0.03 mg·kg－1，持續(xù)注射2周。每天記錄各組大鼠體質(zhì)量變化及行為學改變。

1.7 各組大鼠給藥方式和ELISA法檢測腹腔注射順鉑結(jié)束1周后，將20只順鉑造模組大鼠再隨機分為模型組和ADMSCs治療組，每組各10只。正常對照組和模型組：將0.5 mL生理鹽水通過尾靜脈注射至大鼠體內(nèi)；ADMSCs治療組：將ADMSCs細胞以1×106mL－1的密度形成懸浮液，按每公斤2×106個細胞的劑量經(jīng)尾靜脈注射，2組大鼠均每3 d注射1次，共注射4次。最后一次注射治療1周后，麻醉正常對照組、模型組和ADMSCs治療組大鼠，心臟取血，收集血清備檢。采用ELISA法檢測大鼠血清雌二醇（estradiol，E2）、卵 泡 刺 激 素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）水平。

1.8 各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)檢測收集大鼠兩側(cè)卵巢組織，去除脂肪后拍照，采用細胞組織固定液固定，將標本制成切片，HE染色觀察各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組大鼠體質(zhì)量和血清E2、FSH及LH水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠ADMSCs培養(yǎng)和鑒定原代ADMSCs在體外培養(yǎng)24 h后細胞開始貼壁生長，細胞較雜，有少量圓形細胞和脂滴漂浮，48 h后少量梭形、圓形、不規(guī)則三角形和多邊形的成纖維狀細胞貼壁，細胞大小不一，仍有少量脂滴，4～6 d后細胞融合生長至培養(yǎng)瓶瓶底面積的70%～80%，細胞大部分伸展，體積變大。經(jīng)3次傳代后細胞逐漸變純，形態(tài)較穩(wěn)定，呈均一、長梭狀的細胞，無漂浮脂滴。生長旺盛時細胞增殖迅速，細胞核較大，呈魚群及旋渦狀生長。見圖1。

圖1 ADMSCs的形態(tài)表現(xiàn)（×100）Fig.1 Morphology of ADMSCs(×100)

成骨誘導至第4天，細胞形態(tài)開始逐漸變大，為圓形和多角形等不規(guī)則形狀，第21天時細胞呈復層生長，形態(tài)較模糊，排列紊亂，細胞間形成鈣質(zhì)沉積。第21天，細胞經(jīng)過1%茜素紅染色后，有紅色鈣結(jié)節(jié)沉積在細胞外基質(zhì)內(nèi)。見圖2。

圖2 ADMSCs向成骨細胞的分化（×100）Fig.2 Differentiation of ADMSCs to osteoblasts（×100）

成脂誘導第4～5天，部分細胞形態(tài)由長梭狀轉(zhuǎn)變成肥大的多形性細胞，并在胞漿內(nèi)可見透光性較好的小中性脂質(zhì)空泡，隨著誘導時間的延長，脂滴的數(shù)量越來越多，并逐漸融合形成較大的脂滴。第14天，胞漿中可見大量大小不一、折光性良好的脂質(zhì)空泡。第21天，細胞經(jīng)油紅O染色后變?yōu)殚偌t色。見圖3。

圖3 ADMSCs向成脂細胞的分化（×100）Fig.3 Differentiation of ADMSCs to adipocytes（×100）

第4代ADMSCs的表面標志物CD44和CD90均呈高表達，表達率分別為75.85%和59.71%；CD45呈低表達，表達率為39.12%。見圖4。

圖4 流式細胞術(shù)檢測ADMSCs表面標志物Fig.4 Surface markers of ADMSCs detected by flow cytometry

大鼠ADMSCs可在體外培養(yǎng)環(huán)境下快速增殖，在P4代接種后均呈典型的“S”形生長曲線，見圖5。消化接種后的第1～2天細胞增長較慢，從第3天起細胞進入對數(shù)生長期，快速增殖，并在第6～7天進入平臺期停止生長。

圖5 P4代ADMSCs的生長曲線Fig.5 Growth curves of P4 generation ADMSCs

2.2 2組大鼠行為學改變和體質(zhì)量正常對照組大鼠體態(tài)活潑，食量、毛發(fā)和大便正常，體質(zhì)量穩(wěn)定。造模組大鼠經(jīng)腹腔注射順鉑4 d后進食不佳，精神頹靡，不愿意進行自主活動，對外界刺激反應亢進。1周后，大鼠毛發(fā)開始蓬亂、無光澤及脫落，體質(zhì)量下降明顯，見圖6。造模組大鼠體質(zhì)量［（203.35±21.74）g］明顯低于正常對照組［（241.27±8.65）g］（P＜0.05）。

圖6 造模期間2組大鼠體質(zhì)量變化曲線Fig.6 Curves of changes of body weights of rats in two groups during modeling period

2.3 各組大鼠治療前后體質(zhì)量和卵巢大體觀察治療前，模型組與ADMSCs治療組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性（表1）。治療后，ADMSCs治療組大鼠體質(zhì)量呈升高趨勢，模型組大鼠體質(zhì)量呈緩慢上升后趨于平穩(wěn)的趨勢（圖7），但二者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對比各組大鼠卵巢組織外觀發(fā)現(xiàn)：正常對照組大鼠卵巢組織體積較大，表面呈淡紅色，可見新鮮卵泡；模型組大鼠卵巢組織體積最小，表面呈灰黃色；ADMSCs治療組大鼠卵巢組織體積大于模型組，接近于正常對照組，表面呈淡粉色（圖8）。

圖7 模型組和ADMSCs治療組大鼠體質(zhì)量Fig.7 Body weights of rats in model group and ADMSCs treatment group

圖8 各組大鼠卵巢組織的外觀表現(xiàn)Fig.8 Morphology of ovary tissue of rats in various groups

2.4 各組大鼠血清E 2、FSH和LH水平與正常對照組比較，模型組大鼠血清E2水平降低（P＜0.05），F(xiàn)SH和LH水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，ADMSCs治療組大鼠血清E2水平明顯升高，F(xiàn)SH和LH水平明顯降低（P＜0.05）；與正常對照組比較，ADMSCs治療組大鼠血清LH和FSH水平較高，E2水平較低，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量和血清激素水平Tab.1 Body weights and serum hormone levels of rats in various groups (n=10，±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量和血清激素水平Tab.1 Body weights and serum hormone levels of rats in various groups (n=10，±s）

*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs model group.

Group E2[ρB/(ng·L－1)]FSH[λB/（IU·L－1）]LH[ρB/(ng·L－1)]Normal control Model ADMSCs treatment Body weight(m/g)Before treatment 269.98±1.29 167.18±15.91 163.41±21.70 After treatment 276.59±4.65 167.62±0.47 168.52±3.64 306.61±216.33 694.55±247.87*400.21±218.80△49.85±14.29 32.56±9.92*45.69±9.13△3.47±0.86 4.20±0.36*3.57±0.69△

2.5 各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)表現(xiàn)HE染色結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組大鼠缺乏各級卵泡，閉鎖卵泡數(shù)增多；與模型組比較，ADMSCs治療組大鼠各級卵泡數(shù)增多，閉鎖卵泡數(shù)減少；與正常對照組比較，ADMSCs治療組大鼠各級卵泡形態(tài)和數(shù)目無明顯差別。見圖9。

圖9 各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.9 Pathomorphology of ovary tissue of rats in various groups(HE,×200）

3 討 論

POF的定義為女性＜40歲時，有閉經(jīng)、FSH＞25 IU·L－1及E2水平降低表現(xiàn)，并伴有潮熱、月經(jīng)改變、骨質(zhì)疏松、乳房萎縮及陰毛和（或）腋毛脫落等不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀，屬于早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）的終末階段［13］。在國外，普通人群POF發(fā)病率約為1%［14］，中國約3.8%，其中特發(fā)性POF約占80%［15］。引起該疾病的病因有很多，如遺傳因素、精神心理狀態(tài)和醫(yī)源性損傷等。并且隨著乳腺癌、卵巢癌和宮頸癌等婦科惡性腫瘤發(fā)病率的上升及癌癥的年輕化，化療性卵巢早衰越來越常見并受到廣泛關(guān)注。POF不僅在精神心理上給女性帶來巨大壓力，還使其機體受損，甚至喪失生育能力。針對POF患者，現(xiàn)有的臨床治療方法很多且利弊共存，包括激素替代治療（hormone replacement therapy，HRT）、誘導排卵［16］、坤泰膠囊聯(lián)合激素療法［17］和針灸療法［18］等。雖然HRT能迅速和高效地改善更年期癥狀，但長時間應用會增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及心臟病等疾病的發(fā)病風險［1］。對于有生育要求的患者，長期誘導排卵可使儲存卵泡被過度消耗，導致病情加重且復發(fā)，進而不利于生育［16］。隨著對干細胞研究的不斷深入，ADMSCs的諸多優(yōu)點不斷被挖掘，國內(nèi)外對其展開了更熱烈的研究，以探討ADMSCs對POF的治療作用。

ADMSCs來自中胚層，與骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）等其他間充質(zhì)干細胞比較，ADMSCs不僅可多向分化且容易獲取，還存在較少的倫理爭議［14］。于2001年ZUK等［19］第一次從脂肪組織血管周圍分離出來ADMSCs并進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其能分化為骨細胞、神經(jīng)細胞和軟骨細胞等多種類型的細胞。研究［2］顯示：ADMSCs在移植后具有歸巢性，主要分布在損傷部位，可發(fā)揮良好的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠抑制樹突細胞（dendritic cells，DCs）成熟，通過負調(diào)節(jié)免疫力，誘導免疫耐受［20］；誘導巨噬細胞極化，下調(diào)免疫應答［21］；抑制NK細胞增殖，使其在組織中保留足夠的時間，在清除之前平衡免疫應答［22］；同時抑制B細胞和T細胞增殖；不表達主要組織相容性復合物Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHC-Ⅱ），并促進前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等因子釋放，進而控制移植后的混合淋巴細胞反應，能有效地抑制宿主的急性免疫反應［23］，明顯延長移植物存活的時間。并且這種免疫抑制作用不僅適用于同種異體間的移植，同樣適用于異種間的移植［14］，將人ADMSCs移植至動物模型中也有一定的治療作用。另外，Angpt1與Zcchc11是兩個與卵巢功能主要相關(guān)的基因。當Angpt1高表達時，可以增加卵巢的血供，促進卵泡的生長；而Zcchc11能上調(diào)IGF-1的表達，從而加快顆粒細胞增殖成長，減少細胞凋亡及使卵泡腔快速形成［24］。將ADMSCs移植至環(huán)磷酰胺誘導的POF小鼠機體后，Angpt1、Zcchc11和Onecut2基因表達明顯增多，CXCR4表達減少，加速了原始卵泡發(fā)育為成熟卵泡的進程。同時ADMSCs可以分泌神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和血小板生長因子（platelet growth factor，PGF）等細胞因子，抑制顆粒細胞凋亡，使卵泡的數(shù)目增多，改善卵巢的功能。

本研究結(jié)果證實：ADMSCs具有粘附性貼壁生長，呈現(xiàn)成纖維樣細胞等間充質(zhì)干細胞的特征，傳代至6代仍維持其表型，具有較強的增殖能力，且具有向成骨和成脂細胞多向分化的能力。這與國內(nèi)外學者的研究［7，25］結(jié)果一致。ADMSCs高表達CD44和CD90，低表達CD45，符合國際細胞治療學會對MSC提出的通用標準。造模組大鼠的E2水平較正常對照組低，而FSH和LH水平較正常對照組高，與卵巢早衰患者機體內(nèi)激素水平的改變相似。另外，通過觀察卵巢組織形態(tài)與病理切片發(fā)現(xiàn)：與正常對照組大鼠比較，模型組大鼠卵巢組織中有更多閉鎖卵泡，各級卵泡數(shù)目明顯減少，缺乏成熟卵泡，卵泡顆粒細胞結(jié)構(gòu)松散，與POF患者卵泡丟失、閉鎖和不排卵的癥狀相符。正常對照組大鼠卵巢組織中始基卵泡、初級卵泡和次級卵泡等各級卵泡均有明顯的細胞増殖，而模型組大鼠卵巢組織中幾乎檢測不到增殖的卵泡，表明順鉑可以顯著抑制卵巢細胞增殖，抑制卵巢分泌功能，誘導卵巢發(fā)生早衰。經(jīng)過ADMSCs治療后，ADMSCs治療組大鼠血清中LH和FSH水平較模型組明顯降低，而E2水平明顯升高，表明ADMSCs能夠在一定程度上恢復卵巢激素水平，改善卵巢功能。HE染色結(jié)果顯示：與正常對照組比較，ADMSCs治療組大鼠各級卵泡形態(tài)和數(shù)目無明顯差別；與模型組比較，ADMSCs治療組大鼠生長的卵泡數(shù)量增多，閉鎖卵泡數(shù)量減少，說明ADMSCs能促進卵泡生長，減輕卵巢的損傷，對POF具有一定的治療作用。

本實驗證實ADMSCs能夠在體外生長繁殖，并具有較強生長增殖能力和多向分化能力；ADMSCs能夠提高POF模型大鼠血清E2水平，對恢復卵巢排卵功能和內(nèi)分泌功能具有一定作用。為臨床治療POF，尤其有生育要求的POF患者尋求了一種安全有效的方法。