宋順佳,王鑫瑩,姜菲菲,賈慧建,趙 遠(yuǎn),楊志平,孫麗媛,趙云冬

（1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院分子生物教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林 吉林 132011）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種有鞭毛的微需氧革蘭陰性桿菌，消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等胃腸道疾病已被證實(shí)與Hp感染高度相關(guān)［1］。1994年，世界衛(wèi)生組織將Hp列為Ⅰ類致癌因子［2］。根除Hp可促進(jìn)消化性潰瘍愈合，并可明顯降低胃癌和胃淋巴瘤發(fā)病率［3］。Hp感染主要發(fā)生在兒童時(shí)期，一旦感染，除非經(jīng)過抗生素治療，否則很難自愈［4］。臨床上常用于治療Hp的幾種常見抗菌藥物有克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林和四環(huán)素等，但是隨著臨床上抗生素的廣泛應(yīng)用，我國Hp根除率越來越低，Hp對(duì)幾種常見抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致其感染治療失敗的主要原因，并且多重耐藥菌株的出現(xiàn)，也給其根除治療帶來極大的困難［5-6］。若在治療前進(jìn)行Hp耐藥性檢測(cè)可以最大限度地減少低效抗菌藥物的使用和藥物不良反應(yīng)及降低抗生素耐藥性。由于Hp分離培養(yǎng)困難，近年來，從分子水平研究Hp耐藥機(jī)制引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。有研究［7］顯示：相關(guān)耐藥基因突變是導(dǎo)致Hp對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制之一，如23S rRNA基因Ⅴ區(qū)上的點(diǎn)突變與克拉霉素耐藥相關(guān)；氟喹諾酮類藥物與gyrA基因所在的喹諾酮類耐藥決定區(qū) （quinolone resistance determining region，QRDR）突變有關(guān)；甲硝唑耐藥主要與rdx A基因突變有關(guān)，但其突變位點(diǎn)多樣，尚未發(fā)現(xiàn)一致位點(diǎn)。由于Hp耐藥機(jī)制復(fù)雜，目前尚無明確的定論，因此，檢測(cè)相關(guān)耐藥基因突變位點(diǎn)對(duì)Hp耐藥機(jī)制的研究具有重要意義。

本研究采用瓊脂稀釋法檢測(cè)Hp對(duì)克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星3種常見抗生素的耐藥性，通過測(cè)序探討相關(guān)耐藥基因23S rRNA、rdxA和gyrA的突變形式，有助于高效、快速和準(zhǔn)確地檢測(cè)Hp抗生素耐藥性，本研究旨在闡明Hp耐藥機(jī)制，為指導(dǎo)臨床合理用藥、提高Hp根除率和有效控制Hp耐藥菌株的傳播提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2020年9月—2021年5月在北華大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科就診的35例患者胃黏膜標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：碳13尿素呼氣試驗(yàn)（Carbon 13 Urea Breath Test，13C-UBT）證實(shí)Hp感染陽性；經(jīng)內(nèi)鏡檢查確診為消化道潰瘍或慢性胃炎；從未接受過根除Hp治療；簽定知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：近4周服用過抗生素、鉍劑和非甾體類抗炎藥者；對(duì)本次治療所用藥物有過敏史者；全身有重大疾病者；胃癌或有胃部切除手術(shù)史者；有精神疾病，不能配合檢查者；孕期及哺乳期者。

1.2 主要試劑和儀器哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、無菌脫纖維綿羊血、Hp選擇性添加劑和微需氧產(chǎn)氣包均購自青島海博生物技術(shù)有限公司，2×Taq PCR Master Mix、D2000 DNA Ladder、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星購自上海源葉生物科技有限公司。Anoxomat MarkⅢ厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)購自廣東省廣州市尤德生物科技有限公司，MJX-160B-Z型霉菌培養(yǎng)箱購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，ETC 811型PCR基因擴(kuò)增儀購自蘇州東勝公司，JY 300E電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，紫外凝膠成像自動(dòng)分析儀購自美國Biorad公司，微量核酸蛋白測(cè)定儀購自美國Thermo公司，高壓蒸汽滅菌器購自上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 Hp分離培養(yǎng)和鑒定胃黏膜標(biāo)本經(jīng)充分研磨后制成組織勻漿，接種至含Hp選擇性添加劑的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，無菌接種環(huán)涂布均勻，置于37℃、微需氧環(huán)境（5%O2、10%CO2、85%N2）中培養(yǎng)3～5 d。觀察菌落形態(tài)，經(jīng)革蘭染色、生化反應(yīng)（氧化酶試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)和觸酶試驗(yàn)）及擴(kuò)增16S rRNA基因鑒定Hp。

1.4 藥敏試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法將以倍比稀釋的不同濃度抗菌藥物分別加入含10%無菌脫纖維綿羊血的M-H血瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后正置待凝固。藥物瓊脂平板終濃度分別為0.031 25、0.062 50、0.125 00、0.250 00、0.500 00、1.000 00、2.000 00、4.000 00、8.000 00、16.000 00、32.000 00和64.000 00 mg·L－1。各個(gè)平板劃分4個(gè)扇區(qū)，每個(gè)扇區(qū)分別接種1株菌。挑取典型菌落研磨至0.9%NaCl溶液中，配制為2麥?zhǔn)媳葷岬木鷳乙海?～3μL菌液，分別滴加于上述平板，此外各菌株接種于無抗生素的平板上作為對(duì)照。置于37℃、微需氧環(huán)境培養(yǎng)3 d后記錄結(jié)果。以抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。參考相關(guān)文獻(xiàn)［8-9］，克拉霉素的MIC≥1.0 mg·L－1定義為耐藥菌株，甲硝唑的MIC≥8.0 mg·L－1定義為耐藥菌株，左氧氟沙星的MIC≥1.0 mg·L－1定義為耐藥菌株。

1.5 基因組DNA的提取采用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取Hp基因組DNA，采用微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)待測(cè)DNA濃度，以波長260 nm處吸光度（A）值和波長280 nm處A值的比值A(chǔ)（260）/A（280）鑒定DNA純度，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。將得到的DNA原液稀釋至約100 mg·L－1，置于－20℃保存。

1.6 特異性引物的設(shè)計(jì)從美國國立生物技術(shù)信息 中 心 （National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫獲取特異性基因16S rRNA和耐藥基因23S rRNA、rdx A及gyrA目的基因序列，采用DNAMAN分子生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)特異性引物，NCBI Primer BLAST評(píng)估引物特異性。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，特異性引物的序列見表1。

表1 特異性引物的序列Tab.1 Sequences of specific primers

1.7 PCR擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，16S rRNA和rdxA最適PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上下游引物（10 mg·L－1）各0.5μL，DNA模板（100 mg·L－1）1μL，無菌ddH2O將體積補(bǔ)足至25μL；23S rRNA和gyrA最適PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上下游引物（10 mg·L－1）各1μL，DNA模板（100 mg·L－1）1μL，無菌ddH2O將體積補(bǔ)足至25μL。最適PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.8 PCR產(chǎn)物檢測(cè)取4μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠上，85 V電泳85 min，停止電泳。將凝膠置于紫外分析儀中觀察，拍照。

1.9 PCR產(chǎn)物純化首先向吸附柱CA 2中加入500μL平衡液BL，12 000 g、1 min，棄去廢液；從瓊脂糖凝膠中切取目的DNA條帶，置于干凈Ep管中，稱質(zhì)量；切膠后Ep管中加入等倍體積溶液PN，封口膜封好，50℃水浴至膠塊充分溶解；所得溶液加入另一吸附柱CA 2中，室溫靜置2 min，12 000 g、60 s，倒廢液；加600μL漂洗液PW，室溫靜置2～5 min后12 000 g離心60 s，倒廢液（重復(fù)1次）；12 000 g空轉(zhuǎn)2 min，室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干；吸附柱CA 2置于另1支干凈Ep管中，向吸附膜中間懸空滴加30μL ddH2O，室溫放置2 min，12 000 g離心2 min，收集DNA液體，重復(fù)1次，提高DNA回收量。

1.10 耐藥基因測(cè)序和比對(duì)將PCR純化后產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取Hp 26695標(biāo)準(zhǔn)菌株的23S rRNA、rdxA和gyrA基因序列，采用DNAMAN和Clustal X 2.0分子生物學(xué)軟件將耐藥基因23S rRNA、rdxA、gyrA序列測(cè)序結(jié)果與Hp 26695標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行比對(duì)，分析核苷酸和氨基酸序列突變位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 Hp菌株的鑒定將Hp菌株培養(yǎng)3～5 d后，平板上可見光滑、半透明和針尖樣的小菌落（圖1）；鏡下可見典型的呈S形、螺旋狀或弧形的革蘭陰性菌（圖2）；氧化酶試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)和觸酶試驗(yàn)結(jié)果均為陽性；Hp菌株擴(kuò)增特異性16S rRNA基因，均于182 bp處出現(xiàn)單一特異明亮條帶（圖3）。

圖1 Hp菌落的形態(tài)表現(xiàn)Fig.1 Morphology of Hp colonies

圖2 鏡下Hp菌落的形態(tài)表現(xiàn)（HE，×1 000）Fig.2 Morphology of Hp colonies under microscope（HE，×1 000）

圖3 部分Hp菌株16S r RNA基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoregram of PCR product of 16S r RNA gene of some Hp strains

2.2 菌株的耐藥情況實(shí)驗(yàn)室35株Hp菌株均對(duì)甲硝唑和左氧氟沙星產(chǎn)生耐藥，28株對(duì)克拉霉素耐藥，耐藥率為80%。見表2。

表2 35株Hp對(duì)3種抗生素的耐藥率Tab.2 Drug resistance rates of 35 strains of Hp to three antibiotics

2.3 耐藥基因的擴(kuò)增將克拉霉素耐藥基因23S rRNA、甲硝唑耐藥基因rdxA和左氧氟沙星耐藥基因gyrA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，于425、851和530 bp處出現(xiàn)單一特異明亮條帶，結(jié)果與預(yù)期相符。見圖4～6。

圖4 部分Hp菌株23S r RNA基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoregram of PCR product of 23S r RNA gene of some Hp strains

圖5 部分Hp菌株rdx A基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoregram of PCR product of rdx A gene of some Hp strains

圖6 部分Hp菌株gyr A基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Electrophoregram of PCR product of gyr A gene of some Hp strains

2.4 23S r RNA基因測(cè)序結(jié)果分析以標(biāo)準(zhǔn)菌株Hp 26695的23S rRNA基因序列作為參考標(biāo)準(zhǔn)，采用DNAMAN軟件將所有Hp菌株核苷酸序列與其比對(duì)（圖7）。28株克拉霉素耐藥菌株均發(fā)生突變，最常見的突變位點(diǎn)為A 2143G，突變率為85.7%（24/28）；A 2223G突變率為10.7%（3/28）；1株菌株發(fā)生A 2142G+A 2164G雙位點(diǎn)聯(lián)合突變（3.6%），而所有敏感菌株均未發(fā)生突變。見表3。

圖7 部分Hp菌株23S r RNA基因核苷酸序列比對(duì)Fig.7 Nucleotide sequence comparison of 23S r RNA gene of some Hp strains

表3 克拉霉素耐藥基因23S r RNA突變位點(diǎn)分析Tab.3 Analysis on 23S rRNA mutation of clarithromycin resistance gene

2.5 rdx A基因測(cè)序結(jié)果分析以標(biāo)準(zhǔn)菌株Hp 26695的rdxA基因序列作為參考標(biāo)準(zhǔn)，采用DNAMAN軟件將Hp菌株核苷酸序列與其比對(duì)，ClustalX 2.0軟件比對(duì)其氨基酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)22株測(cè)序甲硝唑耐藥菌株均發(fā)生突變，突變位點(diǎn)分布隨機(jī)且散在。其中，錯(cuò)義突變?yōu)橹饕耐蛔冃问剑?7.3%（17/22）；核苷酸插入或缺失發(fā)生移碼突變導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止占18.2%（4/22）；13.6%（3/22）出現(xiàn)無義突變導(dǎo)致過早終止密碼子。見表4。

表4 甲硝唑耐藥基因rdxA核苷酸和氨基酸突變位點(diǎn)分析Tab.4 Analysis on nucleotide and amino acid mutations in metronidazole resistance gene rdxA

2.6 gyr A基因測(cè)序結(jié)果分析以標(biāo)準(zhǔn)菌株Hp 26695的gyrA基因序列作為參考標(biāo)準(zhǔn)，采用DNAMAN軟件比對(duì)所有菌株氨基酸序列（圖8）。35株左氧氟沙星耐藥菌株中，N87K突變率為65.7%（23/35）；D91N突變率為8.5%（3/35）；各有1株Hp分別發(fā)生N87I、D91G和N 87K+D143E雙位點(diǎn)聯(lián)合突變，突變率為2.9%（1/35）；另有6個(gè)耐藥菌株（17.1%，6/35）gyrA基因未發(fā)生任何位點(diǎn)突變。見表5。

表5 左氧氟沙星耐藥基因gyr A突變位點(diǎn)分析Tab.5 Analysis on gyrA mutation in levofloxacin resistance gene

圖8 部分Hp菌株gyr A基因氨基酸序列比對(duì)Fig.8 Amino acid sequence comparison of gyr A gene of some Hp strains

3 討 論

Hp可在胃內(nèi)低pH環(huán)境下長時(shí)間存活，對(duì)胃黏膜具有破壞作用，是唯一可以在胃內(nèi)定殖的病原體［10］。研究［11-12］顯示：世界上約有一半人口感染了該病原體，然而不同地區(qū)的感染率不同，其中發(fā)展中國家的感染率高于發(fā)達(dá)國家，我國的Hp感染率為40%～70%。既往臨床上根除Hp的首選方法是質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）聯(lián)用兩種抗生素組成的三聯(lián)療法，但是由于抗生素的不規(guī)范使用，Hp的耐藥率逐年上升，標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法治療Hp的根除率明顯降低［13-14］。第五次全國Hp

感染處理共識(shí)報(bào)告推薦“鉍劑+質(zhì)子泵抑制劑+2種抗菌藥物”組成的四聯(lián)療法為一線根除治療方案［15］。在我國，Hp對(duì)克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星等抗生素的耐藥率呈上升趨勢(shì)，并且具有多重耐藥性，但Hp對(duì)四環(huán)素和阿莫西林的耐藥率較低，在治療方案中應(yīng)合理選擇抗生素［16］。因此，闡明和鑒定Hp耐藥的分子機(jī)制，對(duì)于開發(fā)新的抗生素，設(shè)計(jì)合理的抗生素組合，提高臨床治療成功率具有重要意義。

Hp對(duì)克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星耐藥主要是由于耐藥基因突變導(dǎo)致。23S rRNA基因Ⅴ區(qū)上點(diǎn)突變是導(dǎo)致Hp對(duì)克拉霉素耐藥的主要原因，主要突變位點(diǎn)有A 2143G、A 2142G和A 2142C［17］。此外還發(fā)現(xiàn)了新的突變位點(diǎn)包括A 2144G［18］、T 2182C［19］、T 2183C［20］、A 2116G、A 2181G［21］、A 2115G和G2111A［22］等，但其突變頻率較低。本研究結(jié)果表明：A 2143G位點(diǎn)突變率占85.7%（24/28），為主要的突變方式；其他突變方式為A 2223G，占10.7%（3/28）；A 2142G和A 2164G位點(diǎn)聯(lián)合突變占3.6%（1/28）。rdxA基因突變是引起甲硝唑耐藥的主要機(jī)制，但是其突變位點(diǎn)分布散在，缺乏規(guī)律［23］。有研究［24］顯示：甲硝唑耐藥株的rdx A基因大部分存在錯(cuò)義突變占32.4%（12/37），無義突變占32.4%（12/37），18.9%（7/37）rdxA等位基因存在核苷酸缺失或插入，導(dǎo)致翻譯移碼。本研究結(jié)果顯示：錯(cuò)義突變是最常見的突變，占77.3%（17/22），移碼突變和無義突變分別占18.2%（4/22）和13.6%（3/22）。Hp對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制已被發(fā)現(xiàn)與gyrA基因的喹諾酮類耐藥決定區(qū)（QRDR）突變有關(guān)，氨基酸替換主要發(fā)生在第87和91位［25-27］。本研究結(jié)果顯示：gyrA最常見的氨基酸突變方式為N87K，占65.7%（23/35），其他突變方式有D91N（8.5%，3/35）、N87I（2.9%，1/35）和D91G（2.9%，1/35）和N87K+D143E（2.9%，1/35），此外有6株耐藥菌未檢測(cè)到突變，提示可能存在其他耐藥機(jī)制，例如外排系統(tǒng)、生物膜或新的耐藥基因突變［28］。

本研究檢測(cè)了Hp對(duì)3種常見抗生素耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)，與以往研究比較，既有相同點(diǎn)，又有新發(fā)現(xiàn)的突變點(diǎn)，本研究結(jié)論為進(jìn)一步探討耐藥機(jī)制提供了依據(jù)，同時(shí)為新藥的研發(fā)提供了方向。