李官虎,郎慶旭,劉純巖,劉 沁,耿夢(mèng)柔,李曉倩,王珍琦

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 國家衛(wèi)健委放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院放射線科，吉林 長春 130041）

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是由缺乏雌激素受體、孕激素受體或人類表 皮 生 長 因 子 受 體2引 起［1］。研 究［2-3］顯 示：TNBC預(yù)后不良。放射治療是TNBC的主要治療方法之一，然而由于TNBC轉(zhuǎn)移潛能和放射敏感性的個(gè)體差異，許多患者出現(xiàn)放射治療失敗，從而導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［4］。因此，有必要制訂新的策略，以加強(qiáng)放射治療的有效性。

組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACi）是一類可有效抑制組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）活性的化合物，具有抗癌活性［5-7］。幾種HDACi已被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于治療T細(xì)胞淋巴瘤［8］。

丙戊酸（valproic acid，VPA）是Ⅰ和Ⅱ類HDAC的有效抑制劑。由于人體對(duì)VPA有耐受性且其不良反應(yīng)較少，因此VPA很可能是一類具有廣泛應(yīng)用前景的化療新藥［9］，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。HDACi單獨(dú)應(yīng)用活性相對(duì)有限，但HDACi可使腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性藥物和輻射獲得性抗性重新致敏［10］。

本研究檢測(cè)VPA與X射線聯(lián)合對(duì)TNBC MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響，驗(yàn)證VPA是否可以增強(qiáng)其輻射敏感性，并探討潛在的作用機(jī)制，為VPA介導(dǎo)的放射增敏機(jī)制研究和提高TNBC對(duì)放射治療的有效率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人TNBC MDA-MB-231細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，采用常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的高糖DMEM，37℃、5%CO2和100%飽和濕度，細(xì)胞每3～4 d（即細(xì)胞鋪滿皿底70%～80%時(shí)）傳代1次。VPA（美國Sigma公司），胎牛血清（浙江杭州四季青生物制品分公司），高糖DMEM（美國Gibco公司），胰蛋白酶（上海生物技術(shù)有限公司），PBS（美國Solarbi公司），DMSO（重慶東方試劑廠），CCK-8試劑盒（美國Bimake公司），F(xiàn)ITC偶聯(lián)Annexin-Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒（美國BD公司），細(xì)胞自噬檢測(cè)試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。TDZ5臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司），Pico&Fresco臺(tái)式離心機(jī)（德國Heraeus公司），X射線深部輻照儀（型號(hào)X-RAD 320 ix，德國PXI公司），高壓鍋（日本Yamato公司），GAX-9240干燥箱（上海博訊公司），CelCulture細(xì)胞培養(yǎng)箱（新加坡ESCO科技有限公司），Epoch酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 照射條件采用X射線深部輻照儀照射，電壓180 kV，電流20 mA，單次源靶距70 cm，劑量率1.0 Gy·min－1，照射時(shí)間4 min，照射劑量4 Gy。

1.3 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔3×103個(gè)細(xì)胞，共8復(fù)孔。分為對(duì)照組、不同濃度（2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mmol·L－1）VPA處理組、4 Gy X射線照射組和不同濃度（2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mmol·L－1）VPA聯(lián)合4 Gy X射線照射組。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24、48和72 h后，采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率，將每孔中的培養(yǎng)液吸出，加入100μL新鮮培養(yǎng)液，再向每孔加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育3 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=（加藥組A值－對(duì)照組A值）/對(duì)照組A值×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率和自噬率將處于指數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞種植于6孔板中，培養(yǎng)24 h，加入VPA（10和25 mmol·L－1）24 h后給予4 Gy X射線照射，細(xì)胞分為對(duì)照組、VPA組、4 Gy X射線照射組、VPA聯(lián)合4 Gy X射線照射組。24和48 h后收集細(xì)胞，采用0.25%胰酶消化為單細(xì)胞懸液后，1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，加入1 mL預(yù)冷的PBS洗滌2次。細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：AnnexinⅤ/PI雙染色，加入AnnexinⅤ-FITC 5μL，室溫避光孵育10 min，加入PI（20 mg·L－1）10μL，室溫避光孵育5 min，尼龍網(wǎng)過濾，吹打混勻后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞自噬率檢測(cè)：加入10 mL丹酰尸胺（monodansylcadavrine，MDC）（50 mmol·L－1），37℃靜置30 min后，1 000 r·min－1離心5 min，棄廢液，加入4%多聚甲醛1 mL避光條件下固定15 min，離心后加入PBS洗滌1次，尼龍網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測(cè)。采用CellQuest軟件收集細(xì)胞，ModFit軟件分析結(jié)果，至少收集1×104個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率和自噬率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，細(xì)胞自噬率=自噬細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖率、凋亡率和自噬率經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Students’st檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖率不同濃度VPA單獨(dú)或聯(lián)合4 Gy X射線作用MDA-MB-231細(xì)胞24、48和72 h后，與對(duì)照組比較，2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mmol·L－1VPA組及2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mmol·L－1VPA聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞增殖率均明顯降低（P＜0.01），并呈濃度和時(shí)間依賴性。與4 Gy X射線照射組比較，2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mmol·L－1VPA組及2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mmol·L－1VPA聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞增殖率均明顯降低（P＜0.01），并呈濃度和時(shí)間依賴性。

作用24 h后，2.5 mmol·L－1VPA聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞增殖率低于2.5 mmol·L－1VPA組（P＜0.05）。作用72 h后，2.5和10.0 mmol·L－1VPA聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞增殖率低于2.5和10.0 mmol·L－1VPA組（P＜0.05）。表明VPA有助于提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞的輻射敏感性，但二者的聯(lián)合作用并未明顯優(yōu)于VPA單獨(dú)作用。見表1。

表1 4 Gy X線照射不同時(shí)間后各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of MDA-MB-231 cells in various groups after treated with 4 Gy X-ray irradiation for different time points （n=8，±s，η/%）

表1 4 Gy X線照射不同時(shí)間后各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of MDA-MB-231 cells in various groups after treated with 4 Gy X-ray irradiation for different time points （n=8，±s，η/%）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 and vs 4 Gy X-ray irradiation group；＃P＜0.05 vs 2.5 mmol·L－1 VPA group；○P＜0.05 vs 10.0 mmol·L－1 VPA group.

Group Proliferation rate Control 4 Gy X-ray irradiation VPA(mmol·L－1)2.5 5.0 10.0 20.0 40.0 VPA(mmol·L－1)+4 Gy X-ray irradiation 2.5 mmol·L－1 VPA+4 Gy X-ray irradiation 5.0 mmol·L－1 VPA+4 Gy X-ray irradiation 10.0 mmol·L－1 VPA+4 Gy X-ray irradiation 20.0 mmol·L－1 VPA+4 Gy X-ray irradiation 40.0 mmol·L－1 VPA+4 Gy X-ray irradiation（t/h） 24 1.00±0.00 0.92±0.04 48 1.00±0.00 1.00±0.01 72 1.00±0.00 0.56±0.02**0.73±0.04*△0.47±0.03*△0.28±0.01*△0.24±0.01*△0.25±0.01*△0.66±0.04*△0.48±0.05*△0.33±0.03*△0.24±0.00*△0.25±0.00*△0.53±0.03*0.36±0.05*△0.23±0.01*△0.14±0.00*△0.14±0.00*△0.41±0.03*△＃0.35±0.01*△0.22±0.00*△○0.14±0.00*△0.14±0.00*△0.632±0.042*△＃0.576±0.024*△0.339±0.020*△0.271±0.009*△0.260±0.003*△0.68±0.02*△0.54±0.04*△0.40±0.03*△0.25±0.00*△0.26±0.01*△

2.2 各組細(xì)胞凋亡率5 mmol·L－1VPA單獨(dú)或聯(lián)合4 Gy X射線作用MDA-MB-231細(xì)胞24和48 h后，與對(duì)照組比較，4 Gy X射線照射組、5 mmol·L－1VPA組和5 mmol·L－1VPA聯(lián) 合4 Gy X射線照射組細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。與4 Gy X射線照射組比較，5 mmol·L－1VPA聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.01）。見圖1和表2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)照射24和48后各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率Fig.1 Apoptotic rates of MDA-MB-231cellsin variousgroupsafter irradiated for 24and 48 h detected by flow cytometry

2.3 各組細(xì)胞自噬率5 mmol·L－1VPA單獨(dú)或聯(lián)合4 Gy X射線作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組和4 Gy X射線照射組比較，5 mmol·L－1VPA組和5 mmol·L－1VPA聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞自噬率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。作用48 h后，與對(duì)照組比較，4 Gy X射線照射組、5 mmol·L－1VPA組和5 mmol·L－1VPA聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞自噬率均明顯升高（P＜0.01）。與4 Gy X射線照射組和5 mmol·L－1VPA組比較，5 mmol·L－1VPA聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞自噬率升高（P＜0.05）。見圖2和表2。

圖2 照射24和48 h后各組MDA-MB-231細(xì)胞自噬率Fig.2 Autophagy rates of MDA-MB-231 cells in various groups after irradiated for 24 and 48 h

表2 照射24和48 h后各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率和自噬率Tab.2 Apoptotic rates and autophagy rates of MDA-MB-231 cells in various groups after irradiated for 24 and 48 h(n=3,，±s，η/%）

表2 照射24和48 h后各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率和自噬率Tab.2 Apoptotic rates and autophagy rates of MDA-MB-231 cells in various groups after irradiated for 24 and 48 h(n=3,，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 and vs 4 Gy X-ray irradiation group；＃P＜0.05 vs 5.0 mmol·L－1 VPA group.

Group Control 4 Gy X-ray irradiation 5.0 mmol·L－1 VPA 5.0 mmol·L－1 VPA+4 Gy X-ray irradiation Apoptotic rate 24 h 6.27.±0.53 10.73±0.81**41.24±6.22*△48 h 6.46±1.26 22.50±2.27**57.91±12.03*△Autophagy rate 24 h 8.17±0.74 8.56±0.49 42.17±3.23**△△48 h 7.73±0.62 32.60±2.43**30.27±1.70**42.39±4.15**△△58.24±3.88**△△38.60±5.49*△40.63±0.65**△＃

3 討 論

乳腺癌是世界范圍內(nèi)確診最多的癌癥，也是女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，僅次于肺癌［11］。盡管乳腺癌在診斷和治療上取得了一定的進(jìn)展，但其異質(zhì)性使得治療這種疾病成為全球性的挑戰(zhàn)，需要采取更有效的治療策略［12］。表觀遺傳失調(diào)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用，因此，以表觀遺傳調(diào)控因子為靶點(diǎn)為腫瘤治療開拓了新的視野［13］。

表觀遺傳類藥物HDACi是一類很有前途的抗腫瘤藥物，因?yàn)槠湓谠S多腫瘤中（包括乳腺癌）中具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期的作用［14］。盡管在臨床試驗(yàn)中，HDACi作為單一藥劑在乳腺癌治療中并未表現(xiàn)出驚人的效果，但有研究［15-16］證明HDACi可提高乳腺癌對(duì)化療和放療的敏感性。以往研究［14，17-19］顯示：HDACi VPA在體外抑制不同類型腫瘤細(xì)胞的增殖，包括乳腺癌細(xì)胞，表現(xiàn)出與其他化療藥物的協(xié)同或加強(qiáng)作用，如與順鉑等藥物聯(lián)合。

本研究結(jié)果顯示：VPA單獨(dú)作用TNBC MDA-MB-231細(xì)胞后，細(xì)胞增殖明顯受抑，并呈濃度和時(shí)間依賴性。最近也有研究［19-21］報(bào)道了VPA以劑量和時(shí)間依賴的方式抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示：VPA作用后，MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率和自噬率均明顯升高，表明VPA通過誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞的凋亡和自噬從而抑制其增殖。以往研究［22-23］顯示：VPA主要通過改變腫瘤細(xì)胞組蛋白乙?；癄顟B(tài)來改變不同基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而引起廣泛的抗腫瘤效應(yīng)，包括抑制多種腫瘤細(xì)胞的增生，促進(jìn)分化和誘導(dǎo)凋亡，增強(qiáng)化療敏感性及逆轉(zhuǎn)腫瘤轉(zhuǎn)移等，本研究在MDA-MB-231細(xì)胞中進(jìn)一步證實(shí)了VPA的抗腫瘤作用，并揭示其機(jī)制是通過誘導(dǎo)凋亡和自噬導(dǎo)致細(xì)胞增殖受抑。

本研究同時(shí)檢測(cè)了VPA聯(lián)合4 Gy X射線照射對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示：細(xì)胞增殖明顯受抑，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞自噬率均明顯升高，且效果優(yōu)于二者單獨(dú)應(yīng)用。表明VPA加強(qiáng)了X射線照射腫瘤生長抑制作用，揭示其機(jī)制是通過誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬。通過VPA的預(yù)先作用，使原本輻射抗性的MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)輻射致敏，即可能增強(qiáng)了其輻射敏感性。最近有研究［24］顯示：HDAC活性升高和組蛋白磷酸乙?；淖兓瘯?huì)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞輻射抗性增加。

自噬信號(hào)是提高腫瘤治療效果的重要靶點(diǎn)。研究［25］顯 示：HDACi辛 二 酰 苯 胺 異 羥 肟 酸（suberanilohydroxamic acid，SAHA）通 過 抑 制TNBC中蛋白激酶（proteinase B，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR）途徑刺激自噬。SAHA通過降低人乳腺癌細(xì)胞中survivin和X連鎖凋亡抑制蛋白（X linked inhibitors of apoptosis protein，XIAP）蛋白的穩(wěn)定性誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和抑制細(xì)胞活力［26］。此外，電離輻射通過調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白PARP-1誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［27］。本研究結(jié)果顯示：?jiǎn)渭僔PA組、單純4 Gy X射線照射組和VPA聯(lián)合4 Gy X射線照射組細(xì)胞自噬率均明顯升高，表明聯(lián)合治療引起MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生自噬。然而，自噬在控制癌癥存活或細(xì)胞死亡中的作用尚存爭(zhēng)議。本研究結(jié)果顯示：聯(lián)合組細(xì)胞增殖率明顯降低，提示自噬對(duì)受到電離輻射和VPA聯(lián)合作用的MDA-MB-231細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用。ZHOU等［28］發(fā)現(xiàn)：抑制自噬可以明顯提高鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性。而CHAACHOUAY等［29］報(bào)道：輻射抗性乳腺癌細(xì)胞照射后顯示出強(qiáng)烈的自噬誘導(dǎo)，然后起到保護(hù)作用。因此，抑制或過度激活自噬是否更有益，仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，VPA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞具有生長抑制作用，并可能有助于提高其輻射敏感性，其機(jī)制涉及VPA誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬。本課題組下一步工作應(yīng)在動(dòng)物模型中進(jìn)一步對(duì)該結(jié)論加以證實(shí)。