李 波 張亞茹 周婭麗 張鵬輝，3 崔亞君 陳藏藏 李彥增

（1河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2河南省果蔬加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453003；3河南雙匯投資發(fā)展股份有限公司技術(shù)中心，河南漯河 462000；4河南世紀(jì)香食用菌開發(fā)有限公司，河南許昌 461100）

靈芝Ganoderma lucidum，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌，其主要功效成分包括多糖和三萜類物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[1]。近年來(lái)，隨著靈芝人工栽培技術(shù)的成熟和推廣，靈芝產(chǎn)量大幅增長(zhǎng)，開展靈芝的精深加工就顯得日益迫切和必要。其中，提取靈芝的功效成分，開發(fā)相關(guān)的功能產(chǎn)品是一條有效途徑。

有關(guān)靈芝三萜和多糖的提取方法已有報(bào)道，主要包括醇提法（三萜）、水提法（多糖）、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶提法等[2?3]。筆者綜合考慮提取效率和成本，對(duì)醇提法、水提法提取靈芝三萜和靈芝多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，并與超聲波輔助提取法進(jìn)行比較，以期為靈芝功效成分的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

靈芝（赤芝）子實(shí)體，由河南世紀(jì)香食用菌開發(fā)有限公司提供。齊墩果酸，購(gòu)自北京庫(kù)爾科技有限公司。葡萄糖，購(gòu)自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

主要設(shè)備：FW400 A傾斜式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 靈芝粉的制備

新鮮靈芝子實(shí)體→洗凈曬干→75℃烘箱干燥8 h→粉碎→過(guò)0.425 mm篩→靈芝粉。

1.3 靈芝三萜的提取

1.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)試驗(yàn)

稱取1 g靈芝粉，加入10 mL不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（80%、90%、95%、100%），在60℃下提取60 min，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝三萜提取率的影響。

1.3.2 提取溫度試驗(yàn)

稱取1 g靈芝粉，加入10 mL無(wú)水乙醇，分別在不同溫度（20℃、40℃、60℃、80℃）條件下提取60 min，研究提取溫度對(duì)靈芝三萜提取率的影響。

1.3.3 提取時(shí)間試驗(yàn)

稱取1 g靈芝粉，加入10 mL無(wú)水乙醇，在60℃下分別提取30 min、60 min、90 min、120 min，研究提取時(shí)間對(duì)靈芝三萜提取率的影響。

1.3.4 提取次數(shù)試驗(yàn)

按最佳條件對(duì)靈芝提取，離心后沉淀加入乙醇進(jìn)行二次提取，共提取3次。測(cè)定每次提取液中靈芝三萜的濃度，研究提取次數(shù)對(duì)靈芝三萜提取效果的影響。

1.3.5 超聲波輔助試驗(yàn)

稱取1 g靈芝粉，加入10 mL無(wú)水乙醇，在60℃下超聲波輔助，分別提取20 min、40 min、60 min、80 min，研究超聲時(shí)間對(duì)靈芝三萜提取率的影響。

1.4 靈芝多糖的提取

1.4.1 提取溫度試驗(yàn)

稱取1 g靈芝粉，加入20 mL去離子水，在不同溫度條件下（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）提取60 min，研究提取溫度對(duì)靈芝多糖提取率的影響。

1.4.2 提取時(shí)間試驗(yàn)

稱取1 g靈芝粉，加入20 mL去離子水，在90℃下 分 別 提 取 不 同 時(shí) 間（30 min、60 min、90 min、120 min），研究提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響。

1.4.3 料液比試驗(yàn)

稱取1 g靈芝粉，加入不同體積（10 mL、20 mL、30 mL）去離子水，在90℃下提取90 min，研究料液比對(duì)靈芝多糖提取率的影響。

1.4.4 提取次數(shù)試驗(yàn)

按最佳條件對(duì)靈芝提取，離心后沉淀加入乙醇進(jìn)行二次提取，共提取3次。測(cè)定每次提取液中靈芝多糖的濃度，研究提取次數(shù)對(duì)靈芝多糖提取效果的影響。

1.4.5 超聲波輔助試驗(yàn)

稱取1 g靈芝粉，加入20 mL去離子水，在80℃下超聲波輔助，分別提取20 min、40 min、60 min、80 min，研究超聲時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)靈芝多糖提取率的影響。

1.5 靈芝三萜的測(cè)定

1.5.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在10 mL比色管中分別吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 0.1 mg/mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，高溫水浴將溶劑蒸干。向比色管中加入5%香草醛?冰乙酸溶液0.4 mL，再加入高氯酸1 mL，搖勻。將比色管置于60℃水浴保持15 min后取出，立即置冰浴中冷卻5 min，然后加冰乙酸5 mL稀釋，搖勻，測(cè)定其在548 nm處的吸光度值[4]。

1.5.2 靈芝三萜提取率的測(cè)定

將靈芝三萜提取液稀釋一定倍數(shù)，按上述方法測(cè)定其在548 nm處的吸光度，得出三萜的濃度。靈芝三萜提取率（%）=CV/m，式中：C是提取液中三萜的濃度（g/mL），V是提取液的體積（mL），m是所取靈芝粉的質(zhì)量（g）。

1.6 靈芝多糖的測(cè)定

1.6.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)單糖，采用苯酚硫酸法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定其在490 nm處的吸光度值[5]。

1.6.2 靈芝多糖提取率的測(cè)定

將靈芝多糖提取液稀釋一定倍數(shù)，按上述方法測(cè)定490 nm處的吸光度，得出多糖的濃度。靈芝多糖提取率（%）=CV/m，式中：C是提取液中多糖的濃度（g/mL），V是提取液的體積（mL），m是所取靈芝的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝三萜的提取

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝三萜提取率的影響

由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，靈芝三萜提取率越高，無(wú)水乙醇的提取率可達(dá)0.74%。由此可見(jiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝三萜提取率有較大影響，無(wú)水乙醇提取效果最佳。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝三萜提取率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)靈芝三萜提取率的影響

由圖2可知，靈芝三萜提取率隨提取溫度升高而提高，提取溫度超過(guò)60℃后趨于平緩。從節(jié)能和成本等考慮，提取溫度以60℃為宜。

圖2 提取溫度對(duì)靈芝三萜提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)靈芝三萜提取率的影響

由圖3可知，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)靈芝三萜提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在60 min時(shí)達(dá)到峰值0.76%。這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間高溫處理會(huì)對(duì)靈芝三萜結(jié)構(gòu)造成破壞，導(dǎo)致提取率降低。綜合考慮，提取時(shí)間以60 min為宜。

圖3 提取時(shí)間對(duì)靈芝三萜提取率的影響

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)靈芝三萜提取率的影響

對(duì)靈芝三萜進(jìn)行3次提取，提取率分別為0.79%、0.14%和0.02%。由此可見(jiàn)，對(duì)靈芝提取2次后，即可將絕大部分三萜提取出來(lái)。

綜上所述，靈芝三萜的最優(yōu)提取方法為：采用10倍無(wú)水乙醇，提取溫度60℃，提取時(shí)間60 min，提取2次。

2.1.5 超聲波輔助提取靈芝三萜

由圖4可知，隨超聲處理時(shí)間延長(zhǎng)，靈芝三萜提取率呈上升趨勢(shì)，在60 min達(dá)最大值，之后反而下降。這可能是因?yàn)槌暡〞?huì)產(chǎn)生空穴效應(yīng)，有助于靈芝細(xì)胞壁的破裂，使三萜類物質(zhì)更容易溶解出來(lái)，從而提高提取率，但長(zhǎng)時(shí)間超聲處理可能會(huì)破壞靈芝三萜的結(jié)構(gòu)，使提取率降低。因此，超聲提取時(shí)間以60 min為宜。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)靈芝三萜提取率的影響

通過(guò)比較，超聲波輔助提取靈芝三萜的提取率為0.88%，高于傳統(tǒng)的乙醇提取法（0.73%），增幅達(dá)20.5%。由于超聲波輔助提取裝置已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，且能耗成本也不太高，因此靈芝三萜的提取可采用超聲波輔助提取的方法。

2.2 靈芝多糖的提取

2.2.1 提取溫度對(duì)靈芝多糖提取率的影響

由圖5可知，隨提取溫度升高靈芝多糖提取率逐漸增加，超過(guò)90℃后增速趨緩。為了節(jié)約能源和避免高溫對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的破壞，提取溫度以90℃為宜。

圖5 提取溫度對(duì)靈芝多糖提取率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響

由圖6可知，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)靈芝多糖提取率呈上升趨勢(shì)，超過(guò)90 min后增幅變小。綜合考慮，提取時(shí)間以90 min為宜。

圖6 提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響

2.2.3 料液比對(duì)靈芝多糖提取率的影響

由圖7可知，加水量越多，靈芝多糖提取率越高，料液比超過(guò)1∶20后增幅趨緩?？紤]加水量過(guò)多會(huì)增加后續(xù)的濃縮成本，因此料液比以1∶20為宜。

圖7 料液比對(duì)靈芝多糖提取率的影響

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)靈芝多糖提取率的影響

對(duì)靈芝多糖進(jìn)行3次提取，提取率分別為2.67%、0.34%和0.15%。由此可見(jiàn)，隨提取次數(shù)增加，能夠提取出來(lái)的多糖數(shù)量越來(lái)越少，第三次提取出的多糖量已經(jīng)很少。綜合考慮提取和后續(xù)的濃縮成本，提取次數(shù)以2次為宜。

綜上所述，熱水提取靈芝多糖的最優(yōu)工藝為：用90℃熱水提取90 min，料液比1∶20，提取2次。

2.2.5 超聲波輔助提取靈芝多糖

由圖8可知，隨超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，靈芝多糖的提取率逐漸增高，超過(guò)60 min后多糖提取率基本趨于穩(wěn)定?？紤]能耗等因素，超聲處理時(shí)間以60 min為宜。

圖8 超聲時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響

通過(guò)比較，超聲輔助提取的多糖提取率為2.75%，高于傳統(tǒng)的熱水提?。?.43%），增幅達(dá)13.2%。這可能是因?yàn)槌暡óa(chǎn)生的空穴效應(yīng)，有助于靈芝細(xì)胞壁的破裂和胞內(nèi)多糖的溶出，從而增強(qiáng)提取效果。

3 結(jié)論

靈芝三萜的最佳提取條件為：采用10倍無(wú)水乙醇，在60℃提取時(shí)間60 min，提取2次。靈芝多糖的最佳提取條件為：采用90℃熱水提取90 min，料液比1∶20，提取2次。按照上述提取方法，靈芝三萜的提取率為0.76%，靈芝多糖提取率為2.67%。采用超聲波輔助提取，靈芝三萜和多糖的提取率可分別增加20.5%和13.2%。研究為靈芝功效成分的提取方法提供有益參考。