鄧小鋒 潘敏娜 鄭常祥

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院旱糧研究所，貴州 貴陽 550006)

引言

高粱是世界第5大作物，是糧食、釀造食品、飼料、生物能源的主要原料之一[1]。糯高梁作為釀造型白酒和醋生產(chǎn)的原料，很早被人們使用。此外，許多傳統(tǒng)的糕點食品，也由糯高梁加工而來。作物籽粒糯質性狀的形成是由于其Wx基因(即GBSSI基因)突變后，籽粒中支鏈淀粉合成增加，而直鏈淀粉合成減少[2]。常規(guī)高梁籽粒胚乳中直鏈淀粉占總淀粉的含量約為22%～24%[3,4]，而典型糯高梁中的直鏈淀粉含量小于2%，幾乎全部為支鏈淀粉。西南地區(qū)是傳統(tǒng)的白酒釀造區(qū)，使用當?shù)氐呐促|高粱作為白酒釀造的原料。已有研究發(fā)現(xiàn)了高粱糯質性狀的4種基因型，分別命名為wxa、wxb和 wxc、wxd[5,6]。本實驗是通過標記檢測和核苷酸直接測序，對高粱Wx的新基因型開展研究，為新基因型的進一步研究與應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗中使用67份貴州省地方高粱材料。對材料籽粒縱切剖面胚乳區(qū)的蠟質情況進行調查，判斷其是否為糯質材料。糯質材料籽粒的剖面胚乳區(qū)呈現(xiàn)像蠟燭一樣的灰白質感，而非糯質籽粒剖面胚乳區(qū)中間區(qū)域呈現(xiàn)白色粉質狀。每份材料取7～8顆完好籽粒，縱剖后觀察蠟質情況。

1.2 實驗方法

1.2.1 高粱材料DNA提取

每份材料在育苗盤中發(fā)苗。3葉期時取材料葉片提取DNA，每份材料取5～8個單株的葉片混合。提取DNA為改良的CTAB法：約0.2g混合葉片，放入1.5mL PE離心管，加入液氮研磨成粉末；每管加入預熱的提取緩沖液500μL，在65℃溫浴1h，每間隔10min溫和混勻1次；離心機中10000r·min-1離心5min，轉移上清液至新離心管；每管加入8μL的RNAse A(10mg·mL-1)，37℃溫浴20min。短暫離心，加入500μL氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液，輕輕顛倒混勻10～15min，直到混液呈白色乳濁狀；12000r·min-1離心10min，轉移上清液至新離心管，再加入500μL的氯仿∶異戊醇混合液，重復以上操作1次；沉淀DNA時，加入適量5mol·L-1NaAc溶液，混勻后加入2倍體積4℃預冷的95%乙醇溶液，-20℃放置1h，于低溫10000r·min-1離心10min，吸出上液，加入預冷的75%乙醇洗滌，10000r·min-1離心5min，吸出上液；再重復洗滌1次；10000r·min-1離心1min后，吸出殘留乙醇，敞開管蓋置于干凈環(huán)境10～15min，隨后每管加入100μL ddH2O，DNA充分溶解后，用微量分光光度計和瓊脂糖電泳檢測DNA的濃度和質量。提取緩沖液：100mmol Tris-HCL(pH 7.5)，25mmol EDTA，1.5mol NaCl，2%(w/v)CTAB；0.3%(v/v)β-mercaptoethanol，在緩沖液預熱前加入。

1.2.2 對材料wxa基因型的檢測

對67份材料進行wxa基因型的檢測。因為wxa基因型的核苷酸序列3號外顯子中插入了1段4000bp的外源序列，對其無法直接測序。根據(jù)Sattler等的方法，其特異引物序列如下：Wxa-F(5′→3′)，CGTGGCGAGATCAAACTCTA；Wx-R(5′→3′)，CTGGTTGTCCTTGTAGTCCGTT；Wx-F(5′→3′)，GGCCTGGATTCAATGTTCTT。PCR擴增體系如表1所示。PCR擴增程序：98℃，60s；98℃，30s；48℃，30s；72℃，62s；共35個循環(huán)；4℃；PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳，Marker為Marker J；612bp的條帶為wxa基因型，523的條帶為非wxa基因型。

表1 PCR擴增體系

1.2.3 對材料wx基因核苷酸序列的保守擴增和測序

除wxa基因型材料外，其它高粱材料的wx基因測序范圍從2號外顯子到14外顯子外，包含了從2-14號外顯子的編碼閱讀框核苷酸序列。序列分段設計引物保守擴增，PCR產(chǎn)物由上海生工有限公司測序。測序的序列拼接后進行分析比較。PCR分段擴增的引物和程序：12-14外顯子區(qū)間，12-14for(5′→3′)：TCGACACCATCATCGAAGGC，12-14rev(5′→3′)：CCACTGGCCACCACTACATT。PCR擴增體系如表2所示。PCR程序：98℃，60s；98℃，30s；53℃，30s；72℃，66s；共35個循環(huán)；4℃；7-13外顯子區(qū)間，7-13for(5′→3′)：ACTGGTTGCCACTTTCACATAC，7-13rev(5′→3′)：GGAGAGGAAGAGAGGACGAAAC。PCR擴增體系如表2所示。PCR程序：98℃，60s；98℃，30s；51℃，30s；72℃，132s；共35個循環(huán)；4℃。

表2 7-14外顯子區(qū)間PCR擴增體系

4-8外顯子區(qū)間，4-8for(5′→3′)：CAGATCAAGATGGGAGACGGGTACGA，4-8rev(5′→3′)：GGTTGGGTTACGATTCATGTCACCTTATGT。PCR擴增體系如表3所示。PCR程序：98℃，60s；98℃，30s；56℃，30s；72℃，117s；共35個循環(huán)；4℃。2-4外顯子區(qū)間，對非wxa基因型的材料，直接擴增2-4外顯子區(qū)間序列。2-4for(5′→3′)：CGTCGCAGCTCGTCGCCACGCAC，2-4rev(5′→3′)：CTCACCGTCTCGTACCCGTCTCCCATCTTG。PCR擴增體系如表4所示。PCR程序：98℃，60s；98℃，30s；63℃，30s；72℃，76s；共35個循環(huán)；4℃。對wxa基因型的材料，使用檢測wxa的引物擴增3號外顯子中外源插入序列右側的區(qū)間序列。Wxa-F(5′→3′)：CGTGGCGAGATCAAACTCTA，Wx-R(5′→3′)：CTGGTTGTCCTTGTAGTCCGTT。PCR擴增體系如表4所示。PCR程序：98℃，60s；98℃，30s；48℃，30s；72℃，62s；共35個循環(huán)；4℃。

表3 4-8外顯子區(qū)間PCR擴增體系

表4 2-4外顯子區(qū)間PCR擴增體系

1.2.4 序列拼接和比對分析

各材料測定的wx基因核苷酸序列用ClustalX軟件比對后，進行人工拼接，對材料間的序列進行比對分析，使用高粱材料BTX623的wx基因序列作為參考序列。彩圖文件的輸出使用Bioedit軟件和Foxit PDF reader。

2 結果與分析

2.1 高粱材料的籽粒剖面情況

67份材料中，籽粒剖面為蠟質的有18份，其余49份為非蠟質，如表5所示。

表5 67份高粱地方材料的籽粒剖面蠟質情況

2.2 提取DNA的質量

提取的67份材料的DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，部分材料如圖1所示。DNA質量較好，可用于后續(xù)的分子標記檢測和測序。

圖1 提取的材料的DNA(部分材料的照片)

2.3 對67份材料wxa基因型的分子標記鑒定結果

對67份材料的wxa基因型的分子標記鑒定結果如圖2及表6所示。

表6 57份材料中鑒定的wxa基因型材料

圖2 對67份高粱材料wxa基因型的鑒定結果

2.4 對67份材料wx基因的2-14外顯子區(qū)間的核苷酸序列比對結果

67份材料的2-14號外顯子區(qū)間核苷酸序列拼接及比對后，鑒定出含wxc、wxd基因型的材料及2種新的wx基因型。

2.4.1 測序鑒定的含有wxc基因型的高粱材料

各材料各區(qū)段核苷酸序列通過拼接和比對后，鑒定出6份高粱材料的wx基因型為wxc，如圖3所示。D29為雜合材料，除wxc基因型外部分D29材料Wx基因2926處核苷酸堿基由G顛換為C，該位置與wxc基因型突變位置相同，因此是一種新的wx基因型。D29中此位置新突變是否也會導致蠟質性狀，還有待進一步研究。此外，C28也是雜合材料，同時含有wxc和野生型。

圖3 測序鑒定的6份高粱材料的wxc基因型

2.4.2 測序鑒定的含有wxd基因型的高粱材料

各材料比對后，鑒定出B20的wx基因型為wxd，如圖4所示。

圖4 測序鑒定的材料B20的wxd基因型

2.4.3 其它材料中wx基因的突變

在12份高粱材料中發(fā)現(xiàn)另一種新的wx基因型，比較于野生型，該基因有13處突變位于編碼框內(nèi)。此外，部分D21材料在2號外顯子1286-1287號核苷酸堿基處還有突變，如圖5所示。

圖5 測序鑒定的12份材料中一種新的wx基因型

這12份材料B3、C22、C34、D7、D15、D21、D36、D40、D49、D59、D70、D79的縱切籽粒剖面顯示其不是蠟質型，因此雖然是一種新的wx基因型，但是該基因型沒有導致Wx蛋白功能喪失。

3 結束語

研究通過分子標記檢測與直接測序分析，從67份材料中鑒定出11份含wxa基因型、6份含wxc基因型、1份含wxd基因型的高粱地方材料。此外還發(fā)現(xiàn)2種新的wx基因型，直接從籽?？v切剖面表型判斷，1種不會導致糯質性狀，位于基因位置2926處堿基由G顛換為C的突變是否會導致糯質性狀或者其它性狀，還有待從雜合材料中分離混合材料后，進一步研究確定。研究為后續(xù)2種新wx基因型的應用與研究提供了科學依據(jù)。