王新輝
(華北制藥股份有限公司倍達(dá)分廠,河北 石家莊 052165)
頭孢氨芐(Cefalexin) 為廣譜類抗生素,可以抑制細(xì)胞壁的合成,使細(xì)胞內(nèi)容物膨脹至破裂溶解,殺死細(xì)菌。為確保仿制藥與原研藥品質(zhì)量和療效一致,保證公眾用藥安全,中國開始推行一致性評價工作,要求仿制藥廠家深入開展對藥品的雜質(zhì)及質(zhì)量的研究工作。在《中華人民共和國藥典》2020 版中頭孢氨芐采用梯度測定有關(guān)物質(zhì),能有效分離7- 氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(雜質(zhì)B 即7-ADCA) 和α- 苯甘氨酸(雜質(zhì)A) 等雜質(zhì),但L- 頭孢氨芐不能基線分離。故通過對流動相、梯度洗脫方法等進(jìn)行優(yōu)化,建立檢測頭孢氨芐中L-頭孢氨芐的方法,并對該方法進(jìn)行驗證。
高效液相色譜儀。
電子天平。
pH 計。
L- 頭孢氨芐對照品,批號為2618-043A2。
頭孢氨芐對照品,批號為1304008-201411。
氫氧化鈉,AR 批號為20210107。
無水磷酸二氫鈉,AR 批號為P1533702。
甲醇,HPLC 批號為21105212。
經(jīng)查閱各國藥典,對比頭孢氨芐有關(guān)物質(zhì)所使用的方法,各國藥典有關(guān)物質(zhì)檢查方法所用色譜柱的種類相同,均為C18 柱;中國藥典和歐洲藥典(英國藥典) 所用流動相緩沖鹽的pH 值、洗脫程序和檢測波長相同,但緩沖鹽的種類和濃度不同;與美國藥典所用流動相、洗脫程序和檢測波長均不同。對各國藥典的有關(guān)物質(zhì)檢查方法進(jìn)行對比優(yōu)化,確定最佳檢測方法。
按照中國藥典、歐洲藥典(英國藥典) 和美國藥典的有關(guān)物質(zhì)檢查方法,分別配制供試品溶液和供試品溶液高溫破壞溶液,分別進(jìn)樣,記錄色譜圖。美國藥典方法的靈敏度低,不采用,中國藥典和歐洲藥典高溫破壞溶液色譜圖如圖1 所示。
圖1 中國藥典和歐洲藥典高溫破壞溶液色譜圖Fig.1 Chromatograms for high-temperature destruction solutions using Ch.P and EP method
由圖1 可看出,中國藥典方法主峰的分離度要優(yōu)于歐洲藥典方法,故在中國藥典頭孢氨芐有關(guān)物質(zhì)的方法上進(jìn)行優(yōu)化對L- 頭孢氨芐進(jìn)行檢驗。
在相同色譜柱、流動相和柱溫條件下,分別設(shè)定流速為1.0 mL/min、1.2 mL/min 和1.5 mL/min,分別精密量取供試品高溫破壞溶液各20 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖。比較不同流速下雜質(zhì)的分離情況,不同流速下色譜圖如圖2 所示。
圖2 不同流速下色譜圖Fig.2 Chromatograms for Different flowvelocity
由圖2 可看出,流速1.5 mL/min 下主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度明顯優(yōu)于其他2 個流速,故方法選擇流速為1.5 mL/min。
在相同色譜柱、流速和柱溫條件下,分別配制0.05 mol/L、0.1 mol/L 和0.2 mol/L 的磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH 值為5.0) 作為流動相A,比較系統(tǒng)適用性溶液的分離情況,不同濃度流動相A 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖對比如圖3 所示。
圖3 不同濃度流動相A系統(tǒng)適用性溶液色譜圖對比Fig.3 Comparison of system suitability chromatograms for different concentrations of mobile phase A
由圖3 可看出,緩沖鹽濃度為0.05 mol/L 時系統(tǒng)適用性溶液中主峰與后臨雜質(zhì)峰間不能達(dá)到分離要求,濃度為0.1 mol/L 和0.2 mol/L 時,主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間均能達(dá)到分離要求。故確定0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 值為5.0) 作為有關(guān)物質(zhì)檢測流動相A。
色譜柱:CAPCELL PAK C18 MGⅡ(4.6*150 mm,5μm),以0.1 mol/L 磷酸二氫鈉(pH 5.0)為流動相A,以甲醇為流動相B,流速為1.5 mL/min,進(jìn)樣量為20μL,檢測器波長為220 nm。梯度洗脫程序為:
B/%梯度洗脫時間/min 0153742555660 A/%989370703098982730307022
3.2.1 流動相A
流動相A 0.1 mol/L 磷酸二氫鈉(pH 值為5.0)溶液。以流動相A 作為空白溶液。
3.2.2 L- 頭孢氨芐對照溶液
L- 頭孢氨芐對照溶液精密稱取L- 頭孢氨芐對照品約2.5 mg,置于5 mL 容量瓶中,使用流動相A 稀釋并定容。移取上述溶液0.02 mL,置于5 mL容量瓶中,加流動相A 稀釋并定容。
3.2.3 混合定位溶液
混合定位溶液取EP 雜質(zhì)A(α- 苯甘氨酸)對照品和雜質(zhì)B(7-ADCA) 對照品各5 mg,分別置兩個10 mL 容量瓶中,加流動相稀釋并定容。稱取頭孢氨芐對照品5 mg,置于5 mL 容量瓶中,用流動相稀釋并定容。取上述各對照品溶液各1.0 mL,置于同一50 mL 容量瓶中,加流動相A 稀釋并定容,作為有關(guān)物質(zhì)混合定位溶液。
3.2.4 雜質(zhì)混合定位溶液
雜質(zhì)混合定位溶液精密稱取L- 頭孢氨芐對照品約2.5 mg,置于5 mL 容量瓶中,使用流動相A稀釋并定容。移取上述溶液0.02 mL,置于5 mL 容量瓶中,加流動相A 稀釋并定容。移取上述溶液0.1 mL 與“有關(guān)物質(zhì)混合定位溶液”0.1 mL 混合,作為雜質(zhì)混合定位溶液。
3.2.5 供試品溶液
供試品溶液取頭孢氨芐供試品10 mg,置100 mL 容量瓶中,加流動相A 稀釋并定容。
3.2.6 對照品溶液對照品溶液
精密量取供試品溶液1.0 mL 置于100 mL 容量瓶中,加流動相A 稀釋并定容。
3.2.7 供試品溶液高溫破壞
供試品溶液高溫破壞取供試品溶液適量,在80 ℃水浴中加熱60 min。
測定方法按方法描述分別稱取L- 頭孢氨芐對照品溶液、對照品溶液和供試品溶液,并分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計算,含L- 頭孢氨芐雜質(zhì)的量不得過0.2%。
取雜質(zhì)混合定位溶液和流動相A(空白溶液)各10 μL,注入高效液相色譜儀,空白溶液在各目標(biāo)峰處無明顯干擾。雜質(zhì)混合定位溶液中各目標(biāo)峰的保留時間與加標(biāo)供試品溶液中的保留時間一致,主峰與相鄰雜質(zhì)分離度分別為2.27、3.26。均滿足專屬性要求??瞻兹芤荷V圖如圖4 所示。
圖4 空白溶液色譜圖Fig.4 Chromatograms of blank solution
圖5 L- 頭孢氨芐定位圖Fig.5 Chromatograms of Location map of L-Cefalexin
儲備液:取L- 頭孢氨芐對照品2.5 mg,置于5 mL 容量瓶中,用流動相A 稀釋并定容。轉(zhuǎn)移上述溶液0.4 mL,置2 mL 容量瓶中,用流動相A 稀釋并定容。取頭孢氨芐對照品2.5 mg,置于5 mL容量瓶中,用流動相A 稀釋并定容,轉(zhuǎn)移上述溶液0.4 mL,置2 mL 容量瓶中,用流動相A 稀釋并定容。取上述兩溶液各0.3 mL,置同一10 mL 容量瓶中,用流動相A 稀釋并定容。
定量限溶液:取上述儲備液1.0 mL,置10 mL容量瓶中,用流動相A 稀釋并定容。
檢測限溶液:取定量限溶液2.5 mL,置5 mL容量瓶中,用流動相A 稀釋并定容。
檢測結(jié)果:L- 頭孢氨芐信噪比S/N 為17.0 ~22.1,滿足信噪比≥10∶1 的要求,定量限濃度為0.3180 μg/mL,相當(dāng)于供試品的濃度百分比0.03%,連續(xù)進(jìn)樣6 針的RSD 為5.8%。
L- 頭孢氨芐信噪比S/N 為7.5,滿足信噪比≥3∶1 的要求,檢測限濃度為0.1590 μg/mL,相當(dāng)于供試品的濃度百分比0.02%,均滿足要求。
取定量限溶液0.4 mL,置于20 mL 容量瓶中,用流動相A 稀釋并定容。作為線性儲備溶液。
分別取線性儲備溶液0.5,1.0,1.5 和2.0 mL轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中,并用流動相A 稀釋定容。將定量限溶液及上述4 種溶液分別進(jìn)高效液相色譜儀,記錄色譜圖。L- 頭孢氨芐線性方程為:y=0.3022x- 0.0078,相關(guān)系數(shù)r 為0.9997。L- 頭孢氨芐濃度范圍:0.3180 ~2.1199 μg/mL,相當(dāng)于供試品的濃度百分比0.03%~0.21%。
準(zhǔn)確度儲備液:取定量限溶液0.4 mL,置于20 mL 容量瓶中,用流動相A 稀釋并定容。
精密稱取頭孢氨芐供試品10 mg 9 份置于10 mL 容量瓶中,分為以下3 組:
(1) 分別移取1.0 mL 定量限儲備液于容量瓶中,并用流動相A 稀釋定容。
(2) 分別移取1.0 mL 準(zhǔn)確度儲備液于容量瓶中,并用流動相A 稀釋定容。
(3) 分別移取1.5 mL 準(zhǔn)確度儲備液于容量瓶中,并用流動相A 稀釋定容。
檢驗結(jié)果說明,LOQ 濃度水平加標(biāo)供試品平均回收率為93%~117%(n=3),回收率的RSD 為14%(n=3),其余水平加標(biāo)供試品溶液各水平的平均回收率均為113%~119%(n=3),回收率的RSD為2%~4%(n=3),符合要求。
精密稱取頭孢氨芐供試品10 mg 6 份置于10 mL 容量瓶中,并各轉(zhuǎn)移1 mL 準(zhǔn)確度儲備液于該容量瓶中,分別進(jìn)樣,計算6 份樣品中L- 頭孢氨芐含量的RSD 值,為2%,符合重復(fù)性的要求。
本文參考各國藥典中頭孢氨芐有關(guān)物質(zhì)的測定方法,通過一系列的試驗研究及對方法的優(yōu)化,建立了梯度的方法對L- 頭孢氨芐的雜質(zhì)進(jìn)行檢測,并通過對方法的專屬性、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度等進(jìn)行驗證,結(jié)果表明,該方法靈敏度好、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高,能有效分析頭孢氨芐及其雜質(zhì)L-頭孢氨芐,為更好的控制頭孢氨芐中的雜質(zhì)提供了依據(jù),可用于頭孢氨芐中L- 頭孢氨芐的檢測和對頭孢氨芐的質(zhì)量控制。