李彩麗，王改麗，柳雨竹，艾曉敏，王真真，李 姿，關繼羽，賀文琦，高 豐，蘭云剛*，陸慧君*

(1.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院，吉林 長春 130062 )

豬血凝性腦脊髓炎(porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)是由豬血凝性腦脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)感染而引起仔豬的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。PHEV是冠狀病毒科β冠狀病毒屬成員，也是首個被發(fā)現(xiàn)能侵害外周中樞神經系統(tǒng)的冠狀病毒[2-3]，主要侵害哺乳期仔豬。感染仔豬臨床主要表現(xiàn)嘔吐、食欲廢絕與典型的神經癥狀[4-5]。近年來PHEV引起的仔豬發(fā)病率與病死率在逐年增加，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失。深入研究PHEV的致病機制能夠為PHE的有效防控提供重要理論依據(jù)。

溶酶體是一種存在于所有真核細胞中的酸性膜結合細胞器，是內吞作用、吞噬作用和自噬傳遞大分子降解和再循環(huán)的中心[6]。溶酶體還參與調控質膜修復、信號轉導和細胞分解代謝等細胞內多種生理過程[7]。研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體體積增大和溶酶體功能紊亂與多種神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關，在多種病毒的致病過程中發(fā)揮重要的調控作用，其功能與膜和管腔中的水解酶和酸化蛋白密切相關。神經嗜性的PHEV侵入細胞后，神經細胞釋放出的病毒粒子被臨近的膠質細胞攝取后，溶酶體囊泡結構將其包裹，可限制病毒進一步擴散[8-9]。然而，PHEV對神經細胞溶酶體功能的影響及機制尚不明確。因此，本研究應用PHEV感染神經瘤母細胞(N2a細胞)的模型，研究溶酶體相關蛋白的變化及溶酶體對PHEV復制影響， 有助于揭示PHEV的分子致病機理，為進一步研究PHE的發(fā)病機制奠定基礎并為該病的科學防控提供新思路。

1 材料與方法

1.1 病毒和細胞PHEV株PHEV-CC14(MF08-3115)[8]、小鼠神經瘤母細胞(N2a細胞)均由吉林大學動物醫(yī)學學院病理解剖實驗室保存。

1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自GIBCO公司；胰蛋白酶購自Sigma公司；5×SDS-PAGE Loading Buffer、RAPI蛋白裂解液(p0013-B)、抗熒光衰減封片劑均購自碧云天生物技術有限公司；PageRuler預染蛋白Marker購自賽默飛公司；2×SYBR Green Master Mixture購于Bimake公司；BafA1、Anti-mouse IgG (H+L),F(ab′)2 Fragment (Alexa Fluor?594 Conjugate) # 8890熒光二抗均購自CST公司；GAPDH抗體、Fluorescein (FITC)-conjugated Affinipure Goat Anti-Rat IgG(H+L)488熒光二抗均購自于Proteintech公司；M-MLV反轉錄酶、RRI、10 mmol/L dNTP、RNAiso Plus Total RNA提取試劑均購自TaKaRa公司；溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)抗體購自BD Pharmingen公司(美國)；溶酶體熒光探針Lyso Tracker Red DND-99購自Invitrogen公司(美國)；PVDF膜(孔徑為0.45 μm)購自Merck Millipore公司；PHEV多抗由本實驗室制備并保存。

1.3 細胞培養(yǎng)與病毒感染將N2a細胞接種于6孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至細胞密度達到60%～80%時進行PHEV感染試驗，以確保接毒后的感染效率。用無血清的培養(yǎng)液先對細胞表面進行清洗，之后向培養(yǎng)瓶中緩緩加入0.2 mL的PHEV病毒液(TCID50為10-4.5/0.1 mL)，將細胞置于培養(yǎng)箱中孵育1 h。隨后，加入含2%血清的DMEM培養(yǎng)液，按試驗需求收集感染PHEV不同時間的細胞樣品。

1.4 LysoTracker Red標記與BafA1處理將N2a細胞接種于12孔板中無菌的細胞爬片上，培養(yǎng)至細胞的密度能夠達到60%左右時，加入0.1 mL PHEV病毒液(TCID50為10-4.5/0.1 mL)，感染48 h后使用50 μmol/L LysoTracker Red在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min以標記溶酶體，然后用37℃ PBS洗滌爬片，封片。

經BafA1抑制劑(300 μmol/L)預處理1 h后的N2a細胞，接種PHEV并以等體積的DMEM作為對照，孵育1 h后，加入含有相同濃度BafA1的DMEM共培養(yǎng)24 h收集樣品，進行后序操作。

1.5 Western blot檢測用含1 mmol/L PMSF的RAPI蛋白裂解液裂解1.3和1.4收集的細胞樣品，置于冰上孵育30 min充分裂解蛋白，然后將樣品以12 000 r/min 4℃離心10 min，以去除雜質；最后加入上樣緩沖液，于微波爐中煮沸10 min 獲得蛋白樣品。進行12%SDS-PAGE電泳后并電轉印至PVDF膜上，10%脫脂奶粉37℃封閉1 h后，分別加入LAMP1、PHEV、GAPDH抗體4℃孵育過夜；TBST清洗5 min/次，洗5次膜后使用HRP標記的二抗孵育，洗膜后ECL顯色，并利用Image J軟件對蛋白進行定量分析。

1.6 熒光定量PCR檢測按照1.3和1.4方法處理細胞后，根據(jù)RNAiso Plus Total RNA提取試劑說明書提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA。在GenBank中查找編碼PHEV N蛋白的基因(AY078417)，使用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物。PHEV-NFP、5′-CCGGAATTCGGTC-TTTCACTCCTGGCAAG-3′和PHEV-NRP：5′-CG-GGGTACCTTATATTTCTGAGGTATC-3′，將引物序列交由庫美生物合成。PCR擴增結束后，回收目的條帶連入pMD18-T載體中，再進行質粒提取，D260 nm值定量，將質粒倍比稀釋作為標準品進行熒光定量PCR反應。同時用同樣的方法設計PHEV特異性引物：上游引物5′-TCTGGGAATCCTGACGAG-3′，下游引物5′-AGGCGCTGCAACACTTAC-3′，檢測PHEV的mRNA表達水平。熒光定量PCR反應體系如下：2×SYBR Green Master Mix 10 μL、cDNA模板2 μL、上下游引物各1 μL、蒸餾水補充至20 μL。反應條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃ 10 min。所得數(shù)據(jù)由QuantstudioTMDesign & Analysis Software version 1.5.1軟件分析。

1.7 間接免疫熒光將N2a細胞接種于含有細胞爬片的12孔板中，待細胞生長密度達到60%左右時，接種PHEV并設置未處理組為空白對照。48 h后棄去培養(yǎng)基，并用PBS洗3次，使用4%多聚甲醛室溫下固定15 min， 然后PBS洗3次，置于含有0.05%TritonX-100的5%脫脂奶粉37℃透膜封閉1 h 后，加入稀釋好的一抗于4℃孵育過夜；次日，PBS洗3次后，加入熒光二抗，37℃避光孵育1 h；PBS清洗細胞爬片，清洗擦干凈后滴加含有DAPI染核的封片劑進行封片。最后，根據(jù)不同的染料選擇不同波段的激發(fā)光，使用激光共聚焦顯微鏡觀察結果采集圖像。

2 結果

2.1 PHEV感染N2a細胞后LAMP1蛋白表達變化收集PHEV感染N2a細胞48 h后的蛋白樣品，通過Western blot方法進行檢測，結果如圖1所示，與空白對照組相比，接毒組LAMP1蛋白表達量顯著升高。

2.2 PHEV與溶酶體的共定位分析按照1.7的方法處理PHEV感染48 h的N2a細胞，用特異性LAMP1單抗和PHEV多抗進行標記，并且以正常N2a細胞作為陰性對照。結果如圖2A所示，對照組N2a細胞中的LAMP1呈現(xiàn)彌散且大小均勻分布，但在感染PHEV的細胞中，定位于細胞核周圍的LAMP1聚集呈現(xiàn)明亮的較大囊泡樣，并且與PHEV共定位表達。此外，通過對形態(tài)大小>1 μm的溶酶體數(shù)量進行統(tǒng)計，結果發(fā)現(xiàn)PHEV感染致溶酶體體積增大(圖2B)。上述結果表明，PHEV能與神經細胞溶酶體共定位，并使溶酶體體積增大。

2.3 PHEV對溶酶體pH的影響PHEV感染N2a細胞48 h后，用溶酶體紅色熒光探針lysotracker進行染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內熒光染色情況。結果如圖3A所示，對照組N2a細胞中，紅色斑點較少且黯淡，但在感染PHEV的細胞中，紅色斑點較多且明亮，并通過Image J軟件對照組和接毒組的單個細胞的熒光強度進行分析，統(tǒng)計結果如圖3B。結果表明，PHEV感染N2a細胞會使溶酶體酸性增強。

A.LysoTracker Red標記PHEV感染的N2a細胞；B.單個細胞的熒光強度

2.4 間接免疫熒光檢測BafA1抑制溶酶體酸化的效果按照1.4的方法使用BafA1處理細胞，使用溶酶體紅色熒光探針lysotracker 進行染色45 min，然后用4%多聚甲醛固定細胞并用特異性LAMP1單抗和PHEV多抗進行熒光標記。結果如圖4所示，BafA1抑制劑處理后，溶酶體熒光探針Lyso TrackerRed的紅色熒光強度都減弱，表明用BafA1抑制劑處理后再接種病毒，BafA1抑制劑起到抑制溶酶體酸化的效果。

圖4 間接免疫熒光檢測BafA1抑制劑預處理N2a細胞

2.5 BafA1預處理N2a細胞后對PHEV復制的影響按照1.4的方法使用BafA1處理細胞，然后感染PHEV 24 h收集細胞裂解液樣品，通過Western blot方法檢測PHEV的表達水平。結果如圖5 A所示，經BafA1預處理細胞后再感染PHEV，細胞裂解液中病毒的表達量明顯低于未處理的感染組。根據(jù)病毒的N基因拷貝數(shù)確定樣品中PHEV基因組RNA的拷貝數(shù)，熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)(圖5B)，胞內的PHEV基因組RNA的拷貝數(shù)下降，病毒含量降低。該結果表明，經BafA1抑制劑預處理N2a細胞后再感染PHEV，能夠阻礙PHEV在N2a細胞中的復制。

A.細胞裂解液中PHEV N蛋白表達變化；B.細胞裂解液中PHEV N基因拷貝數(shù)變化

3 討論

PHEV為β冠狀病毒屬的成員，主要侵害仔豬，尤其是3周齡以內的哺乳仔豬感染率最高，被感染仔豬臨床上主要表現(xiàn)為神經癥狀、嘔吐和衰竭等[5,11]。近年來不斷有豬場暴發(fā)PHE的報道，豬感染PHEV非常普遍且呈世界性分布，PHEV對養(yǎng)豬業(yè)存在巨大的危害。此外，2015年美國密歇根州暴發(fā)新型PHEV，被感染成年豬表現(xiàn)出流感樣癥狀[12]，說明PHEV還存在變異流行的風險。因此對PHEV致病機制的研究尤為重要。

溶酶體是真核細胞中廣泛存在的一種富含酸性水解酶的細胞器，由一個帶有膜蛋白和酸性管腔的單層脂質組成，主要通過降解內源和外源性大分子物質來維持細胞內的動態(tài)平衡；而功能紊亂可導致致病相關蛋白的過度積累使正常的細胞功能逐漸喪失[13-14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體功能的紊亂與多種神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。溶酶體功能紊亂可導致致病相關蛋白過度積累致使疾病發(fā)生[15]，如：溶酶體系統(tǒng)的改變，導致β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積進而誘發(fā)阿爾茨海默癥(AD)；亨廷頓病(HD)是由突變亨廷頓蛋白在溶酶體中緩慢積累，改變了溶酶體活性，導致聚集的突變亨廷頓蛋白降解異常引起的。目前研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體在多種病毒的致病過程中發(fā)揮重要的調控作用，如：甲型流感病毒神經氨酸酶(NA)直接結合溶酶體相關膜蛋白并誘導溶酶體破裂，進一步導致宿主細胞死亡[7]。

當前新冠肺炎的暴發(fā)對全球人類健康造成了相當大的危害，新冠病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是其暴發(fā)的病原體[16]。SARS-CoV-2進入細胞依賴于病毒刺突(S)蛋白與細胞受體的結合以及被宿主細胞蛋白酶裂解(比如組織蛋白酶L和組織蛋白酶B)的刺突蛋白，而組織蛋白酶L和組織蛋白酶B是溶酶體途徑的重要組成部分，2種酶幾乎都位于溶酶體中[17]。冠狀病毒通過S蛋白吸附到細胞表面受體后，溶酶體蛋白酶通過裂解冠狀病毒表面刺突蛋白，激活宿主和病毒膜的融合，幫助病毒進入宿主細胞的細胞質，溶酶體蛋白酶在冠狀病毒入侵中發(fā)揮關鍵作用，先是通過晚期核內體/MVBs從高爾基體/TGN到溶酶體的直接途徑，第2種更迂回的途徑是通過逆行轉運回到ER/ERGIC，病毒再到達溶酶體[18-19]。利用溶酶體中的組織蛋白酶L和組織蛋白酶B以及細胞外胰蛋白酶獨立激活S蛋白進行膜融合[20]。研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體酸化是溶酶體酶的穩(wěn)定性和酶的活性所必需的，即使pH值的微小增加也足以抑制這些酶并停止其關鍵的生物學功能[21]，如BafA1預處理細胞阻止溶酶體酸化，從而抑制了豬三角冠狀病毒(PDCoV)進入細胞[22]。PHEV是一種嗜神經性病毒，能夠侵入中樞神經系統(tǒng)(CNS)，引起急性感染和宿主神經功能障礙，PHEV感染后溶酶體相關蛋白的變化及溶酶體酸性環(huán)境對PHEV的影響研究仍有待闡明。

在本研究中，首先我們利用Western blot的方法對PHEV感染N2a細胞后對溶酶體相關蛋白的影響進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)PHEV感染后溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)重組蛋白總量顯著升高。溶酶體結構和功能的完整性需要溶酶體相關膜蛋白以及腔內組織蛋白酶的共同調節(jié)，由此推測PHEV感染可能引起了神經細胞溶酶體功能的紊亂。為了進一步明確PHEV感染對溶酶體的影響，我們進行了間接免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)病毒能與神經細胞溶酶體共定位，并使溶酶體體積增大，我們推測病毒感染改變了溶酶體的形態(tài)。隨后，我們用溶酶體熒光探針Lyso TrackerRed DND-99標記PHEV感染48 h后的N2a細胞，結果發(fā)現(xiàn)病毒感染后會使溶酶體的酸性增強，提示溶酶體酸性微環(huán)境可能對PHEV的生命周期造成影響。為了進一步明確溶酶體酸性微環(huán)境對PHEV復制的影響，我們使用BafA1預處理細胞使空泡型H+-ATP酶受到抑制進而阻止溶酶體酸化，經Western blot和熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，感染PHEV后胞內病毒含量卻表現(xiàn)出明顯低于未經BafA1處理的感染組。結果表明，在溶酶體酸化環(huán)境受到抑制時，PHEV復制也會受到阻礙，胞內子代病毒含量顯著降低。具體相關調控機制研究仍有待開展。

綜上，本研究結果表明PHEV感染神經細胞能定位于溶酶體，影響溶酶體的形態(tài)和功能，并引起溶酶體相關蛋白和組織蛋白的變化及溶酶體酸性微環(huán)境改變對PHEV復制的作用。上述研究結果不僅有助于揭示PHEV的致病機制，以及為PHE的防制研究提供新思路，同時還可以為研究溶酶體在其他神經系統(tǒng)病毒感染性疾病中的作用提供研究基礎。