龐 峰,龍琴琴，程振濤,2

(1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院 貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心,貴州 貴陽 550016)

羊口瘡病毒(orf virus,ORFV)是一種線性雙鏈DNA 病毒，屬于痘病毒科，脊索動物痘病毒亞科，副痘病毒屬?；蚪M大小約135 kb，編碼 132個基因，基因組中心區(qū)域 (ORFs 009-111 ) 包含病毒復(fù)制和病毒粒子形成所必需的基因，而約占基因組20%的兩端基因 (ORFs 001-008，112-134 ) 主要與病毒毒力、致病性、免疫逃避與免疫抑制以及宿主范圍有關(guān)[1-3]。ORFV編碼多個免疫調(diào)控基因[3-7]，其中血管內(nèi)皮生長因子VEGF能增加血管的通透性，促進血管內(nèi)皮細胞增殖，有利于病毒的復(fù)制和傷口結(jié)痂[8]；ORFV125是一個Bcl-2樣蛋白，能夠抑制紫外照射引起的細胞凋亡[9]；ORFV 干擾素抗性基因 OVIFNR 能競爭性的結(jié)合病毒dsRNA，抑制蛋白激酶PKR激活,阻止IFN通過激活PKR抑制病毒蛋白翻譯[10]。

在哺乳動物中，核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)家族包含5個成員，NF-κB1 p50、NF-κB2 p52、RelA/p65、c-Rel和 RelB。通常情況下，NF-κB二聚體與κB 抑制劑IκB蛋白在胞漿中結(jié)合并受到其抑制，處于非活性狀態(tài)[11-13]。NF-κB可通過經(jīng)典NF-κB信號通路和非經(jīng)典NF-κB信號通路激活。經(jīng)典NF-κB信號通路介導(dǎo)NF-κB1 p50、RelA/p65 和c-Rel的激活[13-15]；非經(jīng)典NF-κB信號通路選擇性的介導(dǎo)NF-κB2 p52和RelB的激活[16-19]。NF-κB參與調(diào)控先天和適應(yīng)性免疫，癌癥、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)、細胞凋亡等過程[20-24]。正痘病毒屬的許多成員編碼多種痘病毒蛋白抑制NF-κB信號通路的激活。比如，痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)至少編碼12個NF-κB抑制蛋白，通過靶向NF-κB信號通路的不同階段，主要通過抑制IKK復(fù)合物的激活發(fā)揮作用[20, 25-26]。然而，通過同源性比對發(fā)現(xiàn)副痘病毒屬病毒編碼的NF-κB抑制蛋白不能發(fā)揮作用，預(yù)示著副痘病毒屬病毒可能編碼新的NF-κB信號通路抑制蛋白。本文將對ORFV編碼的多個NF-κB抑制基因進行綜述，使大家對羊口瘡病毒抑制NF-κB信號通路的策略和機制有更系統(tǒng)全面的認識。

1 NF-κB信號通路與病毒感染

經(jīng)典NF-κB信號通路的激活需要激活受體、接頭蛋白、IKK、IκBα和p50/p65。當(dāng)細胞受體感受到外部刺激時，它們會通過接頭蛋白將信號傳遞至IKK，導(dǎo)致IKK磷酸化，IκBα降解，p50/p65核轉(zhuǎn)移以及NF-κB活化[27-30]。多種病毒可以通過不同方式干擾NF-κB信號通路，以逃避宿主的免疫應(yīng)答[31-33]。病毒干擾NF-κB信號通路最直接方法是降低受體和接頭蛋白的mRNA和蛋白水平。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的NSP11蛋白降低RIG-1受體和MAVS接頭蛋白的表達水平，抑制NF-κB的激活[34]。戊型肝炎病毒(HEV)開放閱讀框3(ORF3)降低TLR4，TRAF6和NOD2的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平來阻斷NF-κB信號通路[35]。此外，病毒可靶向IKK復(fù)合體抑制NF-κB信號通路。丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3競爭性結(jié)合NEMO，導(dǎo)致LUBAC介導(dǎo)的NEMO線性泛素化減少，抑制NF-κB信號通路[36]。傳染性軟疣病毒(MCV)MC160蛋白涉及降低IKKα的蛋白水平以及IKKα和IKKβ的磷酸化水平，以達到干擾NF-κB的目的。病毒還可以通過靶向IκBα，抑制IκBα的磷酸化和泛素化來抑制NF-κB的激活。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)NSP1通過抑制IκBα的磷酸化和IκBα的泛素化降解，阻斷p65的核易位抑制NF-κB的激活[37]。病毒蛋白還可以通過結(jié)合p50和p65,抑制NF-κB二聚體入核來阻滯NF-κB的激活。皰疹病毒HSV-1 Us3蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過其激酶活性與p65相互作用，并在絲氨酸75的位點使p65過度磷酸化，從而抑制p65的核易位[38]。

在與宿主的長期斗爭中，痘病毒已經(jīng)進化中多種策略抑制NF-κB信號通路調(diào)控的基因表達，以實現(xiàn)其對宿主的感染。痘病毒編碼的NF-κB抑制基因的基本特征[26]包括：病毒成員可編碼多個NF-κB抑制基因。如痘苗病毒至少編碼12個NF-κB抑制基因(如A52、 A46、B14、C4、N1L、K7、M2L、A49、K1L和E3L)[39-45]；與其他痘病毒免疫調(diào)控基因相比，痘病毒NF-κB抑制基因與宿主蛋白沒有或只有較低的同源性；盡管抑制基因可以作用于NF-κB信號通路調(diào)控的細胞外、細胞質(zhì)、細胞膜和細胞核過程，大多數(shù)的NF-κB抑制基因直接靶向于NF-κB亞單位或IKK 復(fù)合體；單個NF-κB抑制基因的缺失似乎對病毒的致病性無影響或只有較小的影響；除少數(shù)例外，單個NF-κB抑制基因的缺失不會導(dǎo)致病毒毒力的完全致弱；大多數(shù)NF-κB抑制基因在病毒感染后早期表達。

2 ORFV編碼的NF-κB 抑制基因

除了VACV E3L基因與ORFV020基因具有同源性外，其他的痘病毒NF-κB抑制基因在副痘病毒屬成員中均無同源性，因此通過同源性比對發(fā)現(xiàn)ORFV NF-κB抑制基因是行不通的?？茖W(xué)家通過構(gòu)建ORFV編碼基因缺失病毒，然后感染宿主細胞，分析基因缺失對NF-κB調(diào)控基因的影響，對ORFV NF-κB抑制基因進行篩選和鑒定。應(yīng)用該方法，已有多個ORFV NF-κB抑制基因被鑒定。

2.1 ORFV024ORFV024是第1個被發(fā)現(xiàn)的ORFV NF-κB抑制基因[46]。它是ORFV早期轉(zhuǎn)錄基因，與其他病毒蛋白和細胞蛋白無同源性。通過同源重組方法構(gòu)建OV-IA82△024缺失病毒，然后將OV-IA82△024和OV-IA82感染原代羊胚胎鼻甲骨細胞(OFTU)，后續(xù)進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)OV-IA82△024導(dǎo)致NF-κB調(diào)控的細胞因子和促炎癥基因(CCL20、CXCL1、CXCL2、IL-6、IL-8、NFKBIA和PTGS2)表達顯著性上調(diào)。OV-IA82△024感染相較于親本病毒OV-IA82顯著激活NF-κB啟動子，同時ORFV024過表達顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB-p65的磷酸化和入核。進一步試驗證明ORFV024顯著抑制了IkBα磷酸化以及IKKα和IKKβ的磷酸化。總的來說，ORFV024通過抑制IKKα/β復(fù)合體的磷酸化來抑制IkBα的磷酸化和降解，從而抑制NF-κB-p65復(fù)合體的磷酸化和核易位，最終達到抑制NF-κB信號通路的目的。OV-IA82△024感染并不會引起自然宿主明顯的臨床癥狀減輕，所以O(shè)RFV024不是ORFV的毒力基因。

2.2 ORFV002ORFV002是一個早晚期痘病毒基因，為ORFV復(fù)制非必需基因，不影響ORFV復(fù)制。在ORFV感染過程中，ORFV002蛋白定位在細胞核。OV-IA82△002缺失病毒感染OFTu細胞導(dǎo)致NF-κB調(diào)控基因(IL-1a、IL-6、IL-8、NFBIA、CCL20、CXCL3、IRF-1、ICAM-1和PTGS2)表達水平上調(diào)[47]。ORFV002顯著抑制LPS或者TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活。ORFV002不能抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB-p65的磷酸化和核易位，但ORFV002的表達導(dǎo)致NF-κB-p65乙?；较陆怠F-κB-p65的乙?；蕾囉趐300與NF-κB-p65的結(jié)合，ORFV002通過干擾p300與NF-κB-p65的結(jié)合，降低NF-κB-p65的乙?；?，達到抑制NF-κB信號通路的目的。IA82△002感染并不會引起自然宿主明顯的臨床癥狀減輕，所以O(shè)RFV002不是ORFV的毒力基因。

2.3 ORFV121ORFV121是ORFV的早晚期轉(zhuǎn)錄基因，編碼300～306個氨基酸，預(yù)測蛋白大小為36 kDa，蛋白在細胞質(zhì)內(nèi)呈點狀分布。IA82△121病毒生長曲線證明缺失ORFV121基因不會影響ORFV在細胞內(nèi)的復(fù)制。同樣的，IA82△121病毒感染OFTu細胞引起NF-κB調(diào)控基因(IL-1a、IL-6、IL-8、NFBIA、CCL20、CXCL3、IRF-1、ICAM-1和PTGS2)表達水平顯著上調(diào)[48]。NF-κB啟動子雙螢光素酶報告基因試驗進一步表明ORFV121抑制NF-κB啟動子活性。過表達ORFV121顯著抑制了LPS和TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平。ORFV121抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB-p65的磷酸化和入核，但并未影響上游IkBα的磷酸化水平?？偟膩碚f，ORFV121通過與NF-κB-p65結(jié)合來抑制NF-κB-p65的磷酸化和入核，從而抑制NF-κB信號通路。動物攻毒試驗證明IA82△121感染引起自然宿主明顯的臨床癥狀減輕，所以O(shè)RFV121是ORFV的毒力基因。

2.4 ORFV073ORFV073為ORFV晚期表達基因，在不同ORFV中高度保守。ORFV073編碼一個大小約為21.9 kDa的病毒粒子蛋白，其主要定位在感染細胞的細胞核。OV-IA82△073缺失病毒一步生長曲線表明，ORFV073是ORFV復(fù)制非必需基因。OV-IA82△073感染OFTu細胞后顯著促進NF-κB調(diào)控基因MMP13、MMP1、CASP4和IL-6的上調(diào)表達。在感染早期，OV-IA82△073會導(dǎo)致細胞NEMO水平升高以及IKKα/β，IκBα和NF-κB-p65的磷酸化[49]。在非感染細胞中，單獨的ORFV073足以抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB-p65的核易位。同樣，在非感染細胞中，ORFV073抑制IKKα/β，IκBα和NF-κB-p65的磷酸化。免疫共沉淀試驗證明ORFV073不能與NF-κB上游調(diào)控因子RIPK1和 TRAF6結(jié)合，而能與NEMO結(jié)合，干擾IKK復(fù)合體的組裝和激活，進而影響NF-κB信號通路的激活。羔羊攻毒試驗證明ORFV073是ORFV的毒力基因。

2.5 ORFV119ORFV119是ORFV早期表達基因，編碼170～206個氨基酸，預(yù)測的蛋白相對分子質(zhì)量大小為18.6～22.2 kDa。ORFV119的C端有一個保守的LxCxE基序(x代表任何氨基酸)。OV-IA82 (MOI=10) 感染OFTu細胞12 和16 h，ORFV119主要在細胞質(zhì)呈點狀分布表達，但在感染24 h,發(fā)現(xiàn)有大量的ORFV119蛋白定位在細胞核。免疫共沉淀試驗證明ORFV119與視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白pRb以LxCxE依賴的的方式互作。轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)表明OV-IA82△119缺失病毒感染OFTu細胞后導(dǎo)致NF-κB調(diào)控基因TNFα、TLR2、NF-κB1和IL36α表達上調(diào)[26]。OV-IA82△119感染導(dǎo)致NF-κB-p65由細胞質(zhì)大量轉(zhuǎn)移到細胞核。進一步試驗表明OV-IA82△119病毒感染早期，顯著上調(diào)IKKα/β，IκBα和NF-κB-p65的磷酸化水平。在未感染細胞中，單獨的ORFV119足夠抑制TNFα誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活。在OFTu細胞敲減pRb或者突變ORFV 119的LxCxE基序，會緩解ORFV119對NF-κB信號通路的抑制作用。說明pRb通過與ORFV119結(jié)合，抑制NF-κB信號通路。為了篩選ORFV119與TNFα誘導(dǎo)的NF-κB信號通路成分的潛在相互作用，研究人員開展了TRAF2,TAK1,RIP1,TRAF6 和NEMO與ORFV119的免疫共沉淀實驗。結(jié)果表明ORFV119只能與TRAF2相結(jié)合，且pRb促進ORFV119與TRAF2相互作用。羔羊攻毒實驗表明ORFV119是ORFV的毒力基因。ORFV119是第1個通過與pRb相互作用干擾NF-κB信號通路的痘病毒蛋白。

2.6 ORFV編碼的錨蛋白大多數(shù)脊索動物痘病毒都可編碼錨蛋白，ORFV作為痘病毒科副痘病毒屬的主要成員，共編碼5種錨蛋白：ORFV008、ORFV123、ORFV126、ORFV128和ORFV129。除痘病毒外，其他病毒幾乎不編碼錨蛋白[50-51]。作為痘病毒蛋白中最大的一個家族，錨蛋白不僅含有多拷貝的ANK基序，同時還具有一個與細胞F-box結(jié)構(gòu)域同源的保守C端結(jié)構(gòu)域。痘病毒錨蛋白的ANK重復(fù)基序主要對痘病毒宿主范圍產(chǎn)生影響，F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)域則負責(zé)介導(dǎo)痘病毒與細胞SCF泛素連接酶產(chǎn)生相互作用。大多數(shù)的錨蛋白可通過與宿主細胞Skp1、Cu11相互作用，抑制NF-κB信號通路[50,52-53]。如鼠痘病毒編碼的4個錨蛋白EVM002、EVM005、EVM154和EVM165均可借助其F-fox結(jié)構(gòu)域靶向結(jié)合SCF連接酶，抑制IκBα的降解從而阻止NF-κB-p65核易位[54]。但ORFV錨蛋白是否類似于其他痘病毒，可通過與SCF結(jié)合抑制宿主細胞NF-κB信號通路呢？國內(nèi)的王曉霞以及景志忠團隊將錨蛋白連接到真核表達載體pCMV-tag2B構(gòu)建錨蛋白表達質(zhì)粒，然后利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析轉(zhuǎn)染不同錨蛋白重組質(zhì)粒對NF-κB相對熒光素酶活性的影響[50-51]。結(jié)果表明，5個錨蛋白均可抑制NF-κB信號通路。ORFV123對NF-κB信號通路的抑制作用最為明顯,ORFV008和ORFV128 次之。ORFV008和ORFV123是ORFV早期表達基因且定位于細胞漿中，二者皆可通過抑制磷酸化的IκBα的降解抑制 NF-κB-p65入核，進而抑制NF-κB信號通路的活化。ORVF128表達于病毒感染細胞的早期且定位于細胞核，也是通過抑制磷酸化的IκBα的降解抑制NF-κB-p65入核，進而抑制NF-κB信號通路活化。

3 小結(jié)與展望

在與宿主的長期斗爭中，ORVF編碼多種蛋白抑制NF-κB信號通路，從而實現(xiàn)免疫逃逸。ORFV024通過抑制IKK復(fù)合體的磷酸化來抑制IkBα的磷酸化，進而抑制NF-κB-p65 磷酸化和核易位，最終達到抑制NF-κB信號通路的目的；ORFV002通過干擾p300與NF-κB-p65的結(jié)合，降低NF-κB-p65的乙?；剑瑥亩种芅F-κB信號通路；ORFV121結(jié)合NF-κB-p65抑制NF-κB-p65的磷酸化和入核，從而抑制NF-κB信號通路；ORFV073通過與NEMO結(jié)合，干擾IKK復(fù)合體的組裝和激活，抑制IKKα/β，IκBα和NF-κB-p65的磷酸化以及NF-κB-p65的核易位，從而抑制NF-κB信號通路的激活；ORFV119通過與pRb相互作用干擾NF-κB信號通路。

目前國內(nèi)有關(guān)ORFV錨蛋白與NF-κB信號通路互作的研究還停留在蛋白水平,通過構(gòu)建錨蛋白缺失病毒，在病毒水平研究它們對NF-κB信號通路的調(diào)控作用將更具有說服力和可信性。ORFV是否還編碼其他NF-κB抑制基因,后續(xù)可通過構(gòu)建ORFV基因缺失病毒，然后感染宿主細胞，分析該基因?qū)F-κB調(diào)控基因表達水平的影響，對潛在的NF-κB抑制基因進行篩選和鑒定。