李 爽，牟瑞營，吐尼牙孜·買買提，趙才軍，張乃生，胡曉宇*,付云賀*

(1 吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春130062；2 臨朐縣畜牧局，山東 臨朐 261000)

在奶牛的泌乳初期或高峰期，往往需要對奶牛飼喂大量的精飼料以滿足產(chǎn)奶的營養(yǎng)需求。然而，這些易發(fā)酵碳水化合物飼料的長期飼喂往往會導(dǎo)致瘤胃pH值的降低，進而導(dǎo)致亞急性瘤胃酸中毒(SARA)的發(fā)生[1-3]。SARA在給乳業(yè)帶來了巨大挑戰(zhàn)的同時，也給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟帶來了巨大的損失，并且給動物福利也帶來了負面影響。研究表明，SARA與腹瀉、蹄葉炎、真胃變位、肝膿腫、全身炎癥、飼料利用率低以及乳脂降低密切相關(guān)[4-5]。

當奶牛飼喂高精飼料時，瘤胃中的非纖維性碳水化合物會促進淀粉酶的發(fā)酵和有機酸的產(chǎn)生，尤其是乳酸[6-9]。在早期階段，大量乳酸可以被乳酸利用菌快速代謝，轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸(SCFAs)，主要是乙酸、丙酸和丁酸[10]。然而，一旦乳酸的產(chǎn)生超過乳酸利用菌的代謝能力，大量乳酸開始在瘤胃中積累，導(dǎo)致瘤胃液pH值迅速下降，誘導(dǎo)SARA的發(fā)生[11-12]。臨床實踐表明，即使采用相似的飼養(yǎng)和管理方式，奶牛對SARA的敏感性也存在很大差異[13]。造成這種變化的原因尚不清楚，但可能是生理和行為的綜合影響，包括瘤胃微生物群組成。一項重要的研究表明，瘤胃微生物群的差異是影響高谷物飼糧耐受或適應(yīng)的重要因素。此外，也有研究報道，與飼喂小麥粉碎物的綿羊相比，瘤胃內(nèi)接種小麥耐受綿羊的瘤胃液后，這些接種瘤胃液的綿羊不會出現(xiàn)進食過度而引發(fā)的消化不良[14]。這些證據(jù)表明，瘤胃微生物群與SARA易感性密切相關(guān)。

越來越多的研究證明，SARA奶牛瘤胃微生物群發(fā)生顯著的改變[15-16]，并且調(diào)節(jié)瘤胃微生物群可以有效改善高精飼料誘發(fā)的SARA[17-18]。然而，瘤胃細菌群落與SARA的易感性之間的關(guān)系尚未見報道。因此，在本研究中，我們評估了SARA耐受奶牛和SARA易感奶牛的瘤胃液中細菌和真菌群落的特點，旨在找到某些能夠使奶牛適應(yīng)瘤胃中高谷物飼料的菌種，以此為依據(jù)篩查SARA耐受奶牛并為SARA的預(yù)防提供一個新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與方法試驗選用16頭來自山東省青州市某牛場的荷斯坦奶牛(2～3歲，泌乳天數(shù)和體質(zhì)量相似)。試驗前，所有動物都飼喂低精飼料(精飼料和粗飼料比值為4∶6)，自由飲水，適應(yīng)環(huán)境15 d后，所有的奶牛都飼喂高精飼料(精飼料和粗飼料比值為7∶3)，每天飼喂2次(5:00和18:00)，自由采食和飲水。6周后，基于瘤胃液的pH值(12 h內(nèi) pH<5.8的時長超過3 h可判定為SARA)，將奶牛分為SARA耐受組(高精飼料喂養(yǎng)6周后SARA陰性的動物)和SARA易感組(高精飼料喂養(yǎng)6周后SARA陽性的動物)。方案由吉林大學(xué)倫理委員會批準(圖1)。

圖1 技術(shù)路線

1.2 樣品采集和分析使用2.0 mm×120 mm針頭和50 mL注射器[19-20]通過瘤胃穿刺收集每個樣本的瘤胃液。分別在喂食高精飼料開始前和6周后采取瘤胃液，將采集樣本在液氮中冷凍并在-80℃保存。進行16S rRNA和ITS1-1F檢測分析。

1.3 DNA提取和Illumina MiSeq測序以及生物信息學(xué)分析使用CTAB/SDS方法提取瘤胃液中的總基因組DNA樣本，并使用無菌水稀釋至1 mg/L。使用特異性引物(16S V4:515F-806R或ITSI-1F-F-ITSI-1F-R)擴增不同區(qū)域的16S rRNA基因或ITSI-1F。所有的PCR反應(yīng)都使用Phusion?高保真PCR Master Mix(New England Biolabs)進行。PCR產(chǎn)物以相等的比例混合，并使用Qiagen凝膠提取試劑盒(Qiagen，Germany)進行純化。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(Ilumina,USA)生成測序文庫，并在Qubit@ 2.0 Fluorometer(Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)上評估文庫質(zhì)量。最后在IluminaHiSeq2500平臺上對文庫進行測序，得到250 bp的配對末端讀數(shù)。

測序深度由稀疏曲線監(jiān)測，其最小一致性截止值為97%，最小對齊長度截止值為100 bp。采用alpha多樣性指數(shù)(包括Ace和Shannon指數(shù))評價各樣本的物種豐富度和多樣性。所有指標用QIIME(1.7.0版)計算，用R軟件(2.15.3版)顯示。利用生物信息學(xué)和進化基因組學(xué)原理建立的Venn圖分析不同類群樣品中核心屬瘤胃液的數(shù)量。采用線性判別分析結(jié)合效應(yīng)大小(LEfSe)分析，鑒定了不同組樣本瘤胃液細菌群落中差異表達的細菌類群。

2 結(jié)果

2.1 瘤胃液pH值高精飼料飼養(yǎng)6周后，根據(jù)瘤胃液pH值將奶牛分為2組，有8頭奶牛為SARA陽性組(瘤胃液pH值為5.77±0.10)，其余8頭牛為SARA陰性組(瘤胃液pH值為6.32±0.09)(表1)。

表1 瘤胃液pH值

2.2 SARA耐受和SARA易感組奶牛瘤胃內(nèi)細菌微生物群落組成的比較在通過質(zhì)量控制測試的熱測序讀數(shù)中，共有1 405 280個讀數(shù)，瘤胃液中每個樣品平均有87 830個讀數(shù)。通過觀察檢測樣本物種積累箱型圖可以得到本次測序量和測序深度符合樣本分析要求(圖2)。

圖2 檢測樣本物種累計箱型圖

為了探索SARA的敏感性是否與奶牛的瘤胃微生物群有關(guān)，我們分析了SARA耐受和SARA易感奶牛瘤胃液中的細菌群落。Ace(P= 0.81)和Shannon指數(shù)(P= 0.37)分析表明，SARA易感奶牛瘤胃液的多樣性高于SARA耐受奶牛，但差異不明顯(圖3A，B)。此外，未加權(quán)UniFrac指標的PCoA顯示，SARA耐受和SARA易感奶牛瘤胃液的細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化(圖3C)。

2.3 SARA耐受和SARA易感奶牛瘤胃內(nèi)細菌群落在門類和屬種層面的比較在門水平上，結(jié)果表明變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、軟壁菌門(Tenericutes)和螺旋菌門(Spirochaetes)在SARA耐受奶牛和SARA易感奶牛瘤胃液中最為豐富(圖4A)。在屬水平上，寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)，未鑒定的瘤胃球菌(unidentified_Ruminococcaceae)，支原體(Mycoplasma)，未鑒定的普雷沃菌(unidentified_Prevotellaceae),未鑒定的理研菌(unidentified_Rikenellacea),未鑒定的擬桿菌(unidentified_Bacteroidales),未鑒定的毛螺菌(unidentified_Lachnospiraceae),未鑒定的藍藻細菌(unidentified_Cyanobacteria),琥珀酸菌(Succiniclasticum)，乳酸桿菌(Lactobacillus)在SARA易感奶牛和SARA耐受奶牛瘤胃液中豐度較高(圖4B)。

A.Ace細菌微生物區(qū)系豐富度；B.Shannon微生物多樣性；C.SARA耐受奶牛和SARA易感奶牛瘤胃液細菌群落組成的PCoA顯示未加權(quán)UniFrac度量差異;SARARes.SARA耐受奶牛；SARAPro.SARA易感奶牛

A.SARA耐受和SARA易感奶牛的瘤胃液中前10個門類的相對豐度;B.SARA耐受和SARA易感奶牛的瘤胃液中前10個屬的相對豐度

Venn圖用于評估細菌群落的獨特性是否與SARA的發(fā)生有關(guān)。如圖5A所示，大多數(shù)屬在SARA耐受組和SARA易感組奶牛之間共享。核心菌屬在SARA耐受組中占所有瘤胃細菌的66.92%，在SARA易感組奶牛中占75.48%。此外，t檢驗分析SARA耐受組和SARA易感組奶牛瘤胃液中細菌屬的差異顯示，SARA易感組奶牛的unidentified_Spirochaetaceae和Anaeroplasma明顯高于SARA耐受組的奶牛(圖5B)。此外，用LEfSe來分析屬水平的生物標志物，線性判別分析(LDA=3.4)也檢測到unidentified_Spirochaetaceae在SARA易感組奶牛中富集(圖5C，D)。此外，瘤胃普雷沃菌(Prevotella_ruminicola)屬的豐度在SARA易感奶牛中也富集，而泰澤雷拉菌屬(Tyzzerella_sp_Marseille_P3062)的豐度在SARA耐受奶牛中富集。這些結(jié)果表明，細菌群落概況，特別是瘤胃液中unidentified_Spirochaetaceae、Anaeroplasma和Prevotella_ruminicola屬的豐度增加，可能與奶牛對SARA的易感性有關(guān)。

2.4 SARA耐受和SARA易感奶牛瘤胃內(nèi)真菌群落的比較通過高通量測序(HTS)， 16個瘤胃樣品的ITS擴增片段共獲得1 097 391條，平均每個瘤胃樣品的ITS擴增片段數(shù)為68 586條。通過觀察檢測樣本物種積累箱型圖可以得到本次測序量和測序深度符合樣本分析要求(圖6)。

圖6 檢測樣本物種累計箱型圖

對SARA耐受奶牛和SARA易感奶牛瘤胃真菌進行α-多樣性分析，Ace(P=0.94)和Shannon(P=0.13)指數(shù)結(jié)果表明，瘤胃真菌豐富度沒有顯著差異，而瘤胃真菌多樣性SARA耐受奶牛高于SARA易感奶牛，雖然差異不顯著(圖7A，B)。此外，未加權(quán)UniFrac度量的PCoA顯示，SARA耐受奶牛和SARA易感奶牛之間的瘤胃液真菌群落特征沒有明顯差異(圖7C)。

2.5 SARA耐受和SARA易感奶牛瘤胃內(nèi)真菌群落在門類和屬種層面的比較進一步分析表明，在SARA耐受組和SARA易感組奶牛中，瘤胃真菌種群以子囊菌門(Ascomycota)、薪假絲酵母菌門(Neocallimastigomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和莫蒂埃雷利菌門(Mortierellimycota)為主(圖8A)。此外，在SARA耐受和SARA易感組奶牛瘤胃液中相對豐度居前10位的菌屬有節(jié)擔菌屬(Wallemia)、鐮刀菌屬(Fusarium)、枝頂孢屬(Acremonium)、癬囊腔菌(Plectosphaerella)、假絲酵母屬(Candida)、枝孢霉屬(Cladosporium)、釘孢屬(Passalora)、曲霉菌(Aspergillus)、莖點霉屬(Phoma)、乳頭狀瘤菌(Papiliotrema)(圖8B)。

此外，Venn圖顯示，大多數(shù)真菌屬在SARA耐受和SARA易感奶牛之間是共享的(圖9A)。在這些OTU中，在SARA耐受組奶牛中核心真菌微生物群大約占69.57%，在SARA易感組奶牛中核心真菌微生物群大約占60.72%。T檢驗顯示，SARA易感奶牛中的Sarocladium豐度較高，而Aspergillus和Papiliotrema的豐度則低于SARA耐受組奶牛(圖9B)。此外，LEfSe還用于鑒定SARA耐受和SARA易感奶牛瘤胃液中真菌類群的豐度?？芍赟ARA易感組奶牛中富含F(xiàn)usarium_oxysporum，SARA耐受組奶牛中Aspergillusgenus和Papiliotrema_laurentii較多(圖9C，D)。這些結(jié)果表明，瘤胃中Sarocladium、Aspergillus、Papiliotrema_laurentii和Fusarium_oxysporum豐度的變化可能與SARA的易感性有關(guān)。

A.Ace真菌微生物區(qū)系豐富度；B.Shannon微生物多樣性；C.SARA耐受奶牛和SARA易感奶牛瘤胃液真菌群落組成的PCoA顯示未加權(quán)UniFrac度量差異;SARARes.SARA耐受奶牛；SARAPro.SARA易感奶牛

A.SARA耐受和SARA易感奶牛的瘤胃液中前10個門類的相對豐度;B.SARA耐受和SARA易感奶牛的瘤胃液中前10個屬的相對豐度

3 討論

近年來，世界范圍內(nèi)奶牛的產(chǎn)奶量大幅提高。同時，牧場經(jīng)常通過增加飼料中精料的比例來滿足奶牛泌乳的營養(yǎng)需求。由此，大量有機酸在瘤胃中積累，通常會誘發(fā)SARA的發(fā)生[21-22]。SARA的發(fā)生通常伴隨著瘤胃微生物群和生理學(xué)的變化，誘發(fā)奶牛系統(tǒng)性代謝紊亂[23]，最終導(dǎo)致奶牛業(yè)的重大經(jīng)濟損失[5,24]。近年來SARA奶牛的瘤胃內(nèi)微生物群，包括細菌、古細菌、真菌和原生動物受到了廣泛的關(guān)注。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，健康奶牛和SARA奶牛的瘤胃微生物群落的差異已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[25-26]。然而，奶牛本身的瘤胃細菌或真菌微生物群的結(jié)構(gòu)是否與SARA的易感性有關(guān)還沒有報道。事實上，了解SARA不同易感性背后的機制是非常重要的，特別是探索瘤胃微生物群在SARA發(fā)展中的作用，這將有助于開發(fā)奶牛SARA潛在有效的預(yù)防策略。因此，我們評估了SARA耐受和SARA易感奶牛瘤胃內(nèi)細菌和真菌微生物群的差異。結(jié)果表明，瘤胃內(nèi)細菌和真菌群落的差異，特別是unidentified_Spirochaetaceae、Anaeroplasma和Prevotella_ruminicola、Sarocladium、Aspergillus、Papiliotrema_laurentii和Fusarium_oxysporum豐度的變化可能與奶牛SARA的易感性有關(guān)。

A.Venn圖顯示了SARA耐受和SARA易感的奶牛之間瘤胃真菌群落中共享和獨特屬的數(shù)量； B.通過T檢驗分析檢測了SARA耐受奶牛SARA易感奶牛在屬水平上的真菌群落差異；C.LEfSe分析的線性判別分析(LDA)評分，顯示了SARA耐受和SARA易感奶牛瘤胃真菌中的生物標志物分類群(LDA>3.5)；D.LEfSe分析產(chǎn)生的支系圖，表明分類群之間的關(guān)系屬于門、類、目、科和屬

瘤胃被認為是影響奶牛各種疾病發(fā)生和發(fā)展的最重要器官之一，瘤胃中的微生物群發(fā)揮著多種重要的生理功能。研究表明，接種健康奶牛的瘤胃液可以加速患瘤胃酸中毒的羊的瘤胃細菌群落平衡和瘤胃細菌功能的恢復(fù)[27]。因此，我們假設(shè)SARA易感性的不同可能與奶牛本身的瘤胃微生物群落的結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。α-多樣性分析表明，SARA耐受和SARA易感奶牛之間的微生物群豐富度和真菌多樣性存在差異。此外，與SARA耐受奶牛相比，SARA易感奶牛的瘤胃細菌中unidentified_Spirochaetaceae、Anaeroplasma和Prevotella_ruminicola的豐度，以及瘤胃真菌Sarocladium和Fusarium_oxysporum的豐度較高，而Aspergillus和、Papiliotrema_laurentii的豐度則較低。研究表明，螺旋體科與瘤胃中的纖維降解能力有關(guān)[28]。基于與瘤胃相關(guān)的微生物進行生物增殖以降解木質(zhì)纖維素的研究表明，螺菌科未培養(yǎng)的成員在厭氧消化器中生產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸方面具有重要作用[29]。Anaeroplasma是由ROBINSOR等[29-30]首次從牛瘤胃液中分離出來的。它是一種革蘭陰性細菌，屬于支原體目，擁有催化酶，能夠部分消化被殺死的革蘭陰性細菌或酪蛋白。瘤胃Anaeroplasma需要脂多糖、膽固醇和可溶性淀粉，并且有能力產(chǎn)生乙醇和乳酸[30]。LAU等[31]提出，Anaeroplasma可以產(chǎn)生淀粉溶解酶，有助于淀粉酶的分解。WANG等[32]也表明，Anaeroplasma可以將糖類發(fā)酵成乙酸鹽和甲酸鹽，瘤胃液中Anaeroplasma的相對豐度與CH4的產(chǎn)生呈正相關(guān)。Prevotella_ruminicola是一種專性厭氧細菌，屬于擬桿菌門，在瘤胃中非常突出，在蛋白質(zhì)和肽的代謝中起著重要作用，并促進瘤胃中半纖維素的利用[33-35]。如上所示，SARA耐受和SARA易感奶牛瘤胃中的大多數(shù)有差異的細菌都與產(chǎn)酸有關(guān)。此外，F(xiàn)usarium_oxysporum是鐮刀菌屬中的絲狀真菌種類，是植物、動物和人類病原體之間的大型物種復(fù)合體，以宿主特異性方式攻擊不同的物種[36-37]。Papiliotrema_laurentii是一種通常在土壤和植物中抑制的酵母，有能力水解聚酯涂層和涂層成分[38]。研究還表明，Papiliotrema_laurentii可以從菊粉水解物中積累細胞內(nèi)脂質(zhì)[39]。我們也知道，曲霉菌的一些種類有能力產(chǎn)生黃曲霉的次級代謝物[40]。BAN等[41]建議將酵母菌和曲霉菌直接作為反芻動物的飼料中的添加劑。Sarocladium是禾本科植物(Poaaceae)的內(nèi)生菌，是本地草原的主要科。有證據(jù)表明，瘤胃中Sarocladium的豐度越高，牛的體質(zhì)量就越高[42]。然而，unidentified_Spirochaetaceae、Anaeroplasma、Prevotella_ruminicola、Sarocladium、Aspergillus、Papiliotrema_laurentii、Fusarium_oxysporum在SARA易感性中是如何發(fā)揮作用的還有待進一步研究。

總之，本研究表明，SARA易感性可能與瘤胃微生物群的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。瘤胃中大量的unidentified_Spirochaetaceae、Anaeroplasma、Prevotella_ruminicola、Sarocladium、Aspergillus、Papiliotrema_laurentii、和Fusarium_oxysporum的變化可能是導(dǎo)致SARA易感性增加的原因。然而，這需要對這些細菌和真菌進行分離和培養(yǎng)，并深入驗證它們在奶牛SARA易感性中的作用。